循环肿瘤细胞和循环肿瘤内皮细胞对尿路上皮癌预后的预测价值*

刘杰 李小航 李安安 刘昕 苗岳松 王志勇

尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC）作为最常见的恶性肿瘤，在中国泌尿系统肿瘤中的发病率及死亡率均位于前列[1]。研究发现，肿瘤的TNM 分期、分级以及血小板与白蛋白比值均有助于预测UC 患者的预后[2-3]，但这些预测指标存在易受临床因素干扰的缺陷。因此，需进一步纳入其他因素对患者的预后进行精准预测。在肿瘤转移的过程中循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和循环肿瘤内皮细胞（circulating tumor-derived endothelial cell，CTEC）起着不可或缺的作用[4]，而CTEC 对预测UC 患者的预后价值有待进一步证实。本研究旨在通过分析外周血中CTC 和CTEC 与UC 患者预后关系，为临床预测患者预后提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2018年5月至2020年1月于承德医学院附属医院首次诊治的161 例患者的临床病理资料，以100 例UC 为试验组，并以患者的肿瘤最大径3 cm 再进行分组[5-6]，以46 例尿路上皮的良性疾病和15 例健康患者为对照组。试验组纳入标准：1）年龄＞18 岁；2）组织病理学确诊为UC 且影像学检查除外合并其他肿瘤。排除标准：1）受试对象合并血管炎、脓毒性休克和周围血管疾病；2）不能耐受手术。本研究获得本院伦理委员会批准，并得到患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 人外周血CTC 差相富集试剂盒、CD31-iFISH CTC 检测试剂盒均购自美国Cytelligen 公司，CD45 单克隆抗体购自美国Abbkine公司。G1-8 023 微型台式真空泵购自中国Kylin-Bell公司，S500-24 荧光原位杂交仪购自德国Leica 公司，DS-Fi1c 显微镜相机购自日本Nikon 公司。

1.2.2 差相富集联合免疫染色荧光原位杂交技术 术前根据Lin 等[7]研究采用差相富集联合免疫染色荧光原位杂交（subtraction enrichment and immunostainingfluorescenceinsituhybridization，SE-iFISH）技术富集及识别CTC 和CTEC。血液样本离心去除血浆，后加入Cytelligen 细胞分离液去除红细胞，再次离心除去白膜层及上清液，加入免疫磁珠（magnetic beads），去除白细胞，加入清洗液洗涤CTC 和CTEC，可得到富含CTC 和CTEC 的细胞悬液，取细胞悬液进行固定、干燥、封片，最后依次加入CEP-8 探针杂交、CD45 单克隆抗体、CD31 单克隆抗体以及DAPI 细胞核染色液进行细胞染色，由两位检验科医生在荧光显微镜下鉴定CTC、CTEC。

1.2.3 CTC 和CTEC 结果判定 荧光显微镜下读片，在红色通道下寻找可疑细胞，无红色外圈（CD45）的蓝色细胞核（DAPI）细胞为可疑目标，并观察CTC 中的红色亮点是否在细胞核内；再转橙色通道确认荧光信号点（CEP8）是否≥3 个；最后转绿色通道，观察可疑细胞核周是否有绿色信号（CD31）。CTC 阳性判定标准为DAPI 阳性、CD45 阴性、CD31 阴性、CEP8≥3 倍体，CTEC 阳性判定标准为DAPI 阳性、CD45 阴性、CD31 阳性、CEP8≥3 倍体。依据受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）确定CTC 和CTEC 的诊断截断值，并分为阳性组和阴性组。

1.2.4 随访 采用电话或定期门诊随访，UC 患者术后1年内每间隔3 个月随访1 次，1～3年内每间隔6个月随访1 次，内容包括影像学和膀胱镜检查。检查结果怀疑复发或转移患者，诊断以组织病理学为金标准。主要终点事件为无进展生存（progression-free survival，PFS）期，为采集血液样本至术后发生复发、转移或死亡的时间。随访截至2021年1月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计数资料采用χ2分析，采用Kaplan-Meier 法和Log rank 法进行生存分析，采用 Cox 比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC 和CTEC 的形态特征

在荧光显微镜下，CTC 为1 个圆形蓝色荧光核，核内有4 个红色信号点，其中DAPI 阳性、CD45 阴性、CD31 阴性、CEP8 为4 倍体（图1A）。CTEC 表现为1 个圆形蓝色荧光核，核内有7 个红色信号点，可见核周成簇点状绿色信号，其中DAPI 阳性、CD45 阴性、CD31 阳性、CEP8 为7 倍体（图1B）。

图1 荧光显微镜下CTC 和CTEC 阳性形态特征

2.2 CTC 和CTEC 截断值的判定

试验组中CTC 和CTEC 阳性率分别为74/100（74.0%）和66/100（66.0%），与对照组中的6/61（9.8%）和3/61（4.9%）进行比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）。CTC 的ROC 曲线AUC 为0.844，当切点为0.5 时Youden 指数最大；CTEC 的AUC 为0.812，当切点为0.5 时Youden 指数最大。因CTC 和CTEC 只能取整数，故以每7.5 mL 外周静脉血中CTC 或CTEC 判定≥1 个为阳性指标（图2）。

图2 试验组与对照组的CTC 和CTECROC 曲线分析

2.3 术前UC 患者的CTC 和CTEC 阳性率与临床特征的关系

UC 患者的肿瘤最大径＜3 cm 的CTC 阳性率为64.8%（35/54），最大径≥3 cm 为84.8%（39/46），差异具有统计学意义（P=0.023）；多发病灶患者的CTEC阳性率为80.5%（33/41），单发病灶为55.9%（33/59），差异具有统计学意义（P=0.011）；患者的CTC 阳性率与病理类型、分化程度、肿瘤T 分期、病灶数比较差异均具有统计学意义（均P＜0.05），CTC 和CTEC 阳性率与其他临床特征比较差异均无统计学意义（均P＞0.05，表1）。

表1 100 例UC 患者的临床特征与术前CTC 及CTEC 检测情况的关系

表1 100 例UC 患者的临床特征与术前CTC 及CTEC 检测情况的关系 （续表1）

2.4 生存分析

100 例UC 患者中位随访时间为14（1～24）个月，其中25 例发生复发或死亡。单因素分析显示肿瘤T分期、病灶数、CTC 组、CTEC 组与PFS 具有显著性相关。将单因素分析中有意义的临床因素纳入Cox比例风险回归模型多因素分析，CTEC 组为患者PFS的独立预后因素（P=0.05，表2～3）。

表2 影响UC 患者预后的Cox 比例风险回归模型单因素分析

CTC 和CTEC 阳性组中位随访时间分别为12.0个月和12.5 个月，分别短于阴性组的20.0 个月和16.5 个月。Kaplan-Meier 法分析显示，肿瘤T3～4期、CTC 和 CTEC 阳性组的术后PFS 显著短于肿瘤T1～2期、CTC 和CTEC 阴性组（P＜0.05），采用Log rank 法分析显示CTEC 组与PFS 相关性最大（P=0.002）。将CTC 组和CTEC 组中同时阳性的患者视为阳性，其余患者视为阴性，结果显示与PFS 具有显著性相关（P＜0.001，图3）。

表3 影响UC 患者预后的Cox 比例风险回归模型多因素分析

图3 Kaplan-Meier 法分析术前各因素对患者术后PFS 的影响

3 讨论

循环罕见细胞（CRC）主要由CTC 和CTEC 组成[4]。研究发现，从原发病灶脱落的肿瘤细胞可发生局部浸润、游走进入血液循环系统、定植靶器官、外渗和迁移，最终形成新的微小转移病灶，而肿瘤的进展取决于血管生成，CTEC 是促进肿瘤血管生成的重要生物标志物[8]。尽管持续有肿瘤细胞从病灶脱落进入血液循环系统中，但其中绝大部分会因机体的免疫力和血流剪切力或氧化应力而被清除[9]。因此，肿瘤患者外周血中的CTC 和CTEC 含量极低，CTC 几乎在每1 亿个外周血细胞中仅有1 个[10]，检测方法的灵敏性显得尤为重要。本研究采用SE-iFISH 技术是一种新型的检测手段，结果显示CTC 灵敏度为74.0%，CTEC 灵敏度为66.0%。Qi 等[11]研究发现，基于叶酸受体α（FRα）技术检测膀胱癌外周血中的CTC 灵敏度为70%。Flaig 等[12]研究显示，CellSearch 技术检测UC患者的CTC 阳性率仅为27.27%。因此，SE-iFISH 技术对UC 患者的诊断性能更佳，可能因为检测过程中不受肿瘤细胞大小、血液渗透压以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响[7]。本研究进一步分析UC 患者临床特征与CTC 和CTEC 阳性率的关系发现，病理类型、肿瘤最大径、分化程度、病灶数和肿瘤T 分期与CTC 阳性率进行比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.05），其中肿瘤T分期越高，患者外周血中的CTC 检出率亦越高，这可能与T3～4期患者更易发生进展、转移相关，而与年龄、性别、浸润程度、是否血尿进行比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究对CTEC 阳性率分析发现，仅病灶数与CTEC 阳性率比较差异具有统计学意义（P=0.011），可能与CTEC 促进肿瘤血管生长和转移密切相关。

Lin 等[4]研究显示，CTEC 与CTC 的相互作用可能在肿瘤复发、转移和形成过程中有重要的作用。Strijbos 等[13]研究发现，采用多种技术检测162 例去势抵抗性前列腺癌患者的CTC 和CTEC 水平，CTEC数目增加组与总生存期（overall survival，OS）下降有关，CTEC 数目≥5 个的患者同样为预测OS 降低的重要因素，Cox 比例风险回归模型多因素分析显示CTC和CTEC 均为患者OS 独立因素。Rink 等[14]采用CellSearch 系统检测术前100 例膀胱癌患者，23 例CTC 阳性患者中14 例复发，而77 例CTC 阴性患者中仅10 例复发，Kaplan-Meier 法分析显示CTC 阳性与肿瘤的复发相关，并且是肿瘤复发和总死亡率的独立预测因素。本研究的中位随访时间为14（1～24）个月，CTC 和CTEC 阳性组UC 患者的中位随访时间明显短于阴性组，生存分析结果显示与PFS 具有显著性相关，提示CTC 和CTEC 在疾病的进展方面具有预测价值，CTC 或CTEC 阴性患者与阳性患者相比，发生不良预后的风险显著升高，对患者预后风险分层具有重要的临床意义。Cox 比例风险回归模型多因素分析表明，CTEC 是UC 患者唯一的独立预后因子，CTEC 阳性患者的肿瘤复发或死亡风险比是CTEC阴性患者的4.471 倍。未来CTEC 可能成为UC 患者预后的有力监测指标。

综上所述，本研究通过对CTC 和CTEC 检测，不仅论证其在预测UC 患者预后的作用，也为将来从分子和细胞层面揭示肿瘤血管生成、进展和转移之间的关系，完善患者的临床诊疗策略起着重要作用。因受限于试验样本量和随访时间的影响，仍需进行前瞻性、多中心、长时间随访进一步完善。