结核杆菌RV1737多肽免疫特性和诊断价值研究

宁 静，张万江，陈创夫，马雅静，吴江东，程 江

结核病仍旧是影响人类健康的传染病之一，潜伏结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)表现变化多端感染缺乏特异性，中国LTBI人数多,早期诊断与预防治疗刻不容缓。目前IGRA阳性是LTBI诊断指标，IGRA用早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培养滤过蛋白(CFP-10)作为特异抗原，寻找并研究新的蛋白抗原对结核病发病机制的理解及LTBI尽早发现诊断有重要意义。

抗原RV1737是潜伏期结核杆菌表达蛋白之一,是较好的T细胞相关候选抗原,而Th的表位对结核感染的诊断有很大潜力和优势，经软件预测并合成抗原RV1737多肽片段，进行IGRA检测方法的验证。多肽作为包被抗原建立ELISA检测结核抗体，方法简便快捷，一般病情越活跃、免疫应答反应越强、则抗体的阳性率会越高，进一步探讨多肽血清学诊断潜力。

1 材料与方法

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1 材料

经DNA star、Vector NT、Bepipred分析，表位序列由强耀生物公司多肽技术平台合成。序列的理化性质见表1。用ABC表示，对照抗原D为融合抗原 ESAT6-CFP10。

表1 多肽序列和理化性质

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2 样本纳入

多肽诱导细胞免疫反应的全血样本纳入：来自石河子大学附属医院感染科、呼吸科，分别分为3组：结核组(tuberculosis，TB)样本共24例，诊断符合《肺结核诊断和治疗指南》中标准: 影像学检查+结核中毒临床症状+实验室指标+抗结核治疗有效的人群；LTBI组样本18例，符合《WS196-2017结核病分类》的新增分组标准：为无免疫缺陷者测PPD大于10 mm或IGRA阳性者；对照组(healthy control，HC)样本17例来自健康体检人群，所有入选者均自愿参与研究，知情同意后采样，符合医学伦理规范。多肽建立间接ELISA，血清样本纳入：TB组，取患者血清作为阳性样本，共65例；HC组，取健康体检者血清为阴性样本110例。

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3 实验步骤

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多肽诱导细胞免疫反应的检测 ① 新鲜全血采集与保存：血液约5 ml存储于室温环境4～6 h分装处理。多肽A、B、C，融合抗原ESAT-6/CPF-10(抗原D)加入分装样本，37 ℃孵育22 h，3 000 r/min，离心5 min取上清液。② IFN-γ检测：依试剂盒流程，450 nm上机检测，OD值计算IFN-γ浓度(pg/ml)。

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多肽建立间接ELISA ① 多肽 A、B、C 用了碳酸盐缓冲液稀释，加入 96 孔板，100 μg/ml 孔，一抗：血清样本(1∶20，1∶50，1∶100稀释)，二抗：HRP标记羊抗人 IgG(1∶5 000，1∶10 000，1∶10 000稀释)，确定最佳血清一抗浓度在1∶100稀释，450 nm吸光度最佳。② 确定了最佳包被及抗体的浓度，采用棋盘滴定法，P/N值(检测得到OD值后阳性血清与阴性血清的相应比值)大于2.1有诊断意义，多肽A、B、C包被浓度分别是0.5 μg/ml、0.2 μg/ml和0.5 μg/ml。③ ELISA方法的可靠性验证，批内实验与批间实验，变异系数均<15%，重复性在可接受范围。其后检测不同组血清。④ 组间的不同多肽的ROC曲线的绘制。

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4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0绘图，SPSS 20.0统计学分析，两独立样本Mann-Whitney检验，多样本比较Kruskal-Wallis检验，

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<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同多肽抗原对全血刺激后释放IFN-γ水平

经多肽A、B、C和抗原D刺激后，LTBI组与TB组IFN-γ水平均明显高于HC组，差异有统计学意义(

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<0.001)。经多肽A、B、C作用后，LTBI组IFN-γ水平明显高于TB组，差异有统计学意义(

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<0.05)，抗原D在LTBI与TB组间差异无统计学意义。见图1。

图1 不同多肽抗原对全血刺激后释放IFN-γ水平

2.2 LTBI组与TB组ROC曲线评估抗原的诊断价值

多肽A、B、C之间的特异性与灵敏度比较，差异无统计学意义(

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>0.05)；A+B+C联合组的灵敏度明显高于多肽A、B、C与融合D，差异有统计学意义(

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<0.05)。见表2。

表2 LTBI组与TB组的IFN-γ值的ROC曲线数据

2.3 多肽抗原在阳性和阴性血清中IgG测定与散点图

TB组中多肽A的IgG抗体吸光度明显大于多肽B、C，差异有统计学意义(

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<0.05)，而HC组中多肽A的IgG抗体吸光度明显小于多肽B、C(图2)。HC组中多肽A、B、C的IgG抗体吸光度均值分别为0.448 8、0.527 7、0.578 5，分别明显低于TB组的1.139 1、0.915 2、0.781 9，差异有统计学意义(

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<0.05)。见图3。

图2 HC组与TB组中不同多肽的抗体IgG分布

图3 HC与TB组中同种多肽检测血清抗体IgG吸光度值分布

2.4 不同多肽在HC组与TB组血清中IgG抗体分布与ROC的绘制

HC组与TB间绘制多肽A、B、C的ROC，分别为0.908、0.847和0.752。多肽A的ROC较高，提示多肽A诊断效能可能优于多肽B和多肽C。联合多肽的曲线面积与单一面积比较，差异有统计学意义(

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<0.05)。见图4。提示联合多肽诊断曲线面积与特异性上升。单独多肽A、B、C测定结核抗IgG 的特异性是83.6%、69.1%、43.6%，灵敏度是87.7%、89.2%、86.2%。联合使用A+B+C多肽，特异性是92.7%，灵敏度是67.7%。若抗体均是阳性为阳性结果，有一个阴性为阴性结果，则不同抗原组合检测结核抗IgG 特异性、灵敏度，阴阳性结果分布的例数情况。见表3。

表3 不同多肽及组合后相关实验诊断指标

图4 HC与TB组间不同多肽检测抗体 IgG 吸光度绘制ROC曲线

3 讨论

中国结核病疫情呈现“三高一低”(感染率高、患病率高、农村疫情高、年递减率低)的态势，新疆省发病率位居前列。中国发病率逐年递降而结核治疗率无显著线性变化，若无更强防治措施难达到 WTO 的 2035 年终止结核病战略目标。结核分枝杆菌感染主要是“带菌免疫”，以细胞免疫机制为主，感染的演变也是多因素的。结核感染检测金标准为抗酸染色后结核菌痰涂片和细菌培养。结核菌素试验(TST)采用纯蛋白衍生物(puriied protein derivative, PPD)检测，方法简易，可能高估潜伏感染率，IGRA阳性可被认为是潜在感染的指标。目前广泛应用的IGRAs商品化试剂有：QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-IT)和T-SPOT.TB(T-SOPT)，有检测成本较高、操作相对复杂的特点，IGRA对活动性和非活动性的结核均有检出能力，在临床诊断和疗效评价方面的意义仍需探讨。以LTBI时高表达蛋白抗原RV1737为切入点，此抗原在LTBI产生较高水平免疫反应。RV1737多肽为基础的IGRA检测，在不同结核感染状态组检测多肽刺激后IFN-γ，与对照融合蛋白ESAT-6/CFP-10刺激后IFN-γ释放量相比高低差异大。联合多肽诊断绘制ROC曲线面积比起单一抗原面积增加。多肽对ATB与LTBI有区分作用，有诊断LTBI候选抗原潜力。

应用RV1737多肽为包被抗原建立间接ELISA，检测结核IgG抗体在TB血清组有较高反应性，多肽A效果突出，观察在多肽组合后情况下结核IgG特异性有所提高。有文献指出高度疑似结核病的患者痰涂片联合抗体检测会降低漏诊率和误诊率的发生，一般认同抗体产生的多少与疾病的活动程度呈正相关。多肽的血清学检测对于疑似结核感染可能有排筛意义。间接ELISA是常用检测抗体的方法，包被抗原特异性越强，实验整体特异性和稳定性会提高，多肽作为包被抗原提升检测的特异性，成本减低且方法便于掌握。人为因素也会对检测干扰，严格规范步骤与操作，吸光度值测量等环节都是必要的。