SPNS2在肝细胞性肝癌中的表达及其与上皮间质转化的关系

张鹤松，张传海，马金良，荚卫东，余继海

肿瘤细胞的转移是肝癌患者预后不佳最主要的特征，该过程涉及很多内外因素。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌形式，占所有原发性肝癌的85%～90%。最新数据显示全球肝癌年新发及死亡病例数分别居于恶性肿瘤第6位和第2位。高发病率及病死率说明现有的手段无法对肿瘤细胞转移患者根治，基于此，该研究希望寻找一个新的药物靶点治愈远处转移的病灶，为后期根治性切除提供契机。鞘氨醇-1-磷酸转运体(sphingosine-1-phosphate transporter 2，SPNS2)是目前肿瘤研究的一个热点，它是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)转运体之一，具有504个氨基酸残基组成的跨膜蛋白。多项研究表明斑马鱼SPNS2缺失造成心裂的作用，后续研究表明其参与淋巴调节、血管形成和免疫调节等功能。近年来，有研究表明SPNS2的表达异常和肿瘤的进展相关，在肺癌、胃癌、结肠癌等中相继开展了一系列与肿瘤相关研究，其中在胃癌研究上，有学者提出SPNS2与上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)相关，但在HCC进展过程中，SPNS2与EMT相关的研究较少。因此，该研究探讨SPNS2在HCC上表达情况与EMT之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料

2018年1月—2019年12月，收集了10例在安徽医科大学附属省立医院肝脏外科行手术切除的HCC患者新鲜癌及癌旁组织(距离癌组织1 cm以上)，同时选取存放在安徽医科大学附属省立医院病理科行肝癌手术的70例组织标本，年龄在24～87(58.10±11.43)岁，其中男性44例，女性26例。术前均未接受抗肿瘤治疗，并且与患者或家属进行了充分沟通和签署了实验知情同意书。

1.2 试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；RT-PCR试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)；β-Actin、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、E-钙黏蛋白(E-cadherin)(中国Zs-BIO公司)；SPNS2(英国Abcam公司)；N-钙黏蛋白(N-cadherin)(上海Santa Cruz公司)。

1.3 方法

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免疫组化 手术中取下的标本切片厚5 μm，3次依次过二甲苯脱蜡、浓度梯度乙醇水化洗去乙醇，在抗原高压修复后，3%过氧化氢室温下孵育20 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，加一抗(浓度分别为E-cadherin，1∶100，N-cadherin，1∶100，SPNS2，1∶200)，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤3次。加二抗，37 ℃孵育20 min；PBS洗涤，甩干，加DAB显色剂，显微镜下控制显色时间(有阳性终止显色)，苏木精复染1 min，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，碳酸锂蓝化1 min，水洗，常规脱水、透明、封片、镜检。

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3

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2

RT-PCR 组织样品加入TRIzol匀浆后参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，定量根据逆转录试剂盒反转录。反转录程序：65 ℃，5 min；42 ℃，60 min；70 ℃，5 min。反应产物即为cDNA，-20 ℃保存备用。以上述反应产物为模板，ABI 7500型RT-PCR循环条件如下：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，设置循环数为40，检测各目的基因Ct值。以GAPDH作为内参，采用2法分析各基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

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Western blot实验 每100 mg组织加入RIPA(强)细胞裂解液1 ml进行冰上匀浆操作，提取组织总蛋白，按照1∶4加入5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热10 min，冷却后样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，每孔30 μg样本。浓缩胶所用电压为80 V，时间为30 min；分离胶所用电压为120 V，时间为1 h。蛋白300 mA恒流转膜;转膜结束后，应用浓度为5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜3 min。分别参考抗体说明书进行抗体稀释，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。相应二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光、显影，以β-Actin为内参，分析各指标的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行分析，肝癌及癌旁组织表达情况及病理特征采用χ检验，癌及对应癌旁组织mRNA和蛋白水平差异采用独立样本

t

检验，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌及癌旁组织HE染色情况

在HE染色400倍的视野下肝癌组织较对应癌旁组织细胞异型性明显，核大深染，易见异型核分裂像，间质血管丰富(图1)。

图1 HE染色结果 ×400

2.2 SPNS2、N-cadherin、E-cadherin蛋白癌及癌旁组织的表达情况

根据免疫组化结果，SPNS2蛋白阳性信号主要定位于细胞膜，通过DAB显色后，将细胞膜呈现棕黄色判别为阳性表达。SPNS2、N-cadherin、E-cadherin在癌及对应癌旁组织差异有统计学意义，其中SPSN2在癌组织中阳性率(60%，42/70)，而在癌旁组织中阳性率为(27.1%，19/70)，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表2和图2。

表2 SPNS2、E-cadherin、N-cadherin在肝癌组织和癌旁组织表达情况

图2 肝癌及癌旁组织中SPNS2、E-cadherin和N-cadherin的表达 SP×400

2.3 SPNS2与临床病理特征之间的关系

评估SPNS2与临床病理特征之间的关系，如表3所示，SPNS2基因与年龄、性别、分化程度差异无统计学意义。而与肝癌TNM分期和微血管侵犯差异有统计学意义(

P

<0.05)。

表3 SPNS2与临床病理特征之间的关系

2.4 SPNS2在肝癌组织及癌旁组织中mRNA和蛋白的表达水平

RT-PCR 和 Western blot检测结果均表明，与癌旁组织比较，癌组织中SPNS2蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义(

t

=4.474，

P

<0.01；

t

=14.015，

P

<0.01)，其中Western blot结果还显示在癌组织中N-cadherin水平升高，E-cadherin水平降低，对应癌旁组织相反，差异有统计学意义(

t

=10.783，

P

<0.01；

t

=13.200，

P

<0.01)。见图3。

图3 SPNS2、N-cadherin、E-cadherin的表达情况

3 讨论

HCC是肝癌最常见类型，在过去30年中，HCC的发病率一直在上升。虽然外科手术是HCC的重要手段，但是肝细胞癌几乎总是在慢性炎症的肝脏中发展，因此，需要综合治疗。在研究HCC的机制时，鉴定新的有效的治疗靶点十分必要。

SPNS2是一种重要的膜转运蛋白，利用细胞膜内外浓度差异造成的电化学势能来转运底物，并参与免疫调节、炎症诱导和血管生成。另外，SPNS2在不同的肿瘤类别和微环境中，其作用也不一致。在小细胞肺癌中，SPNS2基因敲减后促进肿瘤的远处定植；在胃癌和结肠癌中，SPNS2基因过表达能促进肿瘤细胞的增殖和转移。该研究中，通过RT-PCR和Western blot实验结果显示SPNS2在HCC癌组织中蛋白和mRNA表达水平较癌旁组织上升，提示SPNS2在HCC中可能是促癌基因。通过免疫组织化学法进一步研究显示SPNS2蛋白阳性信号主要定位于细胞膜，在HCC癌组织中的阳性率高达60%，而在癌旁组织中的阳性率只有27.1%，该结果显示SPNS2和HCC可能相关，还提示了SPNS2是个跨膜蛋白，其表达异常可能引起细胞形态改变或黏附能力下降。

研究表明EMT是肿瘤进展中的重要的一个环节，涉及多个转录因子参与，其中E-cadherin和N-cadherin是典型的细胞黏附分子，其表达下调或上升可使细胞的黏附能力发生改变。上述通过免疫定位提示SPNS2是膜蛋白，其表达异常可能使肿瘤细胞黏附能力下降，进一步推测SPNS2可能诱导EMT的发生从而促进HCC的进展。因而，选取了E-cadherin和N-cadherin两个典型的黏附分子，免疫组织化学和Western blot实验结果显示HCC癌组织中E-cadherin表达下降，N-cadherin表达上升。两种实验结果改变方向均和EMT进程一致，使肿瘤细胞的黏附能力下降。

最后该课题结合临床样本数据，结果显示，年龄、性别、分化程度与SPNS2差异无统计学意义，与肿瘤TNM分期和血管侵犯等病理特征密切相关，差异有统计学意义。临床分期较晚和血管侵犯是评估HCC患者预后不良的关键因素，分析SPNS2与HCC患者病理数据之间的关系具有实际意义，为患者预后提供参考意见，也表明了SPNS2具有现实研究价值。

综上所述，该研究表明了SPNS2在HCC中存在差异性表达，并且和临床病理特征相关，可能通过调控EMT发生促进HCC进展而发挥促癌基因的作用。因此，后期该课题组将从细胞水平，进一步研究SPNS2影响HCC的EMT现象发生的相关机制。