艾灸督脉改变AD转基因小鼠事件相关电位P300的分析研究

★ 钟倩 朱才丰 宋小鸽 杨骏 潘洪萍 贺成功 杨坤 秦晓凤（.安徽中医药大学研究生院 合肥 008；.安徽中医药大学第二附属医院老年病三科 合肥 006；.安徽中医药大学针灸经络研究所 合肥 008；.安徽中医药大学第一附属医院针灸康复科 合肥 008）

老年性痴呆，即阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD），是一种器质性精神障碍疾病，主要表现为认知功能的下降，随着全球人口老龄化步伐加快，本病的发病率迅速攀升，已经日益成为医疗卫生事业的沉重负担［1］。P300认知电位是对认知功能进行评价的的一种客观方法，是反映大脑对信息加工、处理的一项有用的指标。从当前研究来看运用P300认知电位来分析阿尔茨海默病小鼠认知电位变化的机制研究相对不足，因此本实验从P300事件相关电位出发来分析艾灸督脉对AD小鼠的认知功能改善的是否有效。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组实验采用雄性APP/PS1双转基因AD小鼠和同龄同背景的雄性野生型C57BL/6J小鼠，所有小鼠由第四军医大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（军）2012-0007，SPF级）。购回后，在通风条件良好的清洁级动物房分笼饲养，温度保持（24±2）℃，每日定时喂养专用饲料及清洁水，环境设置为昼夜明暗交替，交替时间为12 h/12 h，饲养1月。

动物分组：购入的雄性AD转基因小鼠和健康野生型雄性C57BL/6J小鼠共计68只，经过Morris水迷宫筛选实验剔除测试成绩较差者，剩余健康野生型C57BL/6J小鼠10只，雄性AD转基因小鼠40只。将健康小鼠设置为正常组，按完全随机法将40只AD转基因小鼠分为模型组、艾灸组、西药I组、西药II组，每组10只。

动物的饲养和实验程序均经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（参考编号：#AUCM-2017-0216）。实验过程中，善待实验动物，避免不必要的伤害或减轻痛苦。

1.2 治疗方法正常组：采用同龄同背景健康野生型 C57BL/6J 雄性小鼠10只，常规饲养，作为空白对照组，不做特殊处理。

模型组：采用10只AD转基因小鼠作为模型组，常规饲养，作为空白对照组，不做特殊处理。

艾灸组：将AD转基因小鼠固定于自制鼠板上，在保持其清醒状态下，根据“十五”规划《实验针灸学》［2］取督脉穴“百会”“天门(风府)”“大椎”并参照模拟人体解剖学定位。在“百会”穴上放置直径2 cm、厚4～6 mm的附子饼，予实按灸使灸火直接实按于附子饼上，待皮肤灼热潮红时迅速提起，反复灸20 min；“天门”“大椎”穴予温和灸，灸至皮肤局部灼热潮红，时间为20min，施灸过程中避免烫伤小鼠。每日治疗1次，周期为2周，每周休息1 d。

西药I组：采用AD转基因小鼠，予腹腔注射雷帕霉素2 mg·kg-1·d-1，1 次/d，疗程与艾灸组平行。

西药II组：采用AD转基因小鼠，艾灸督脉治疗的同时予腹腔注射抑制自噬药物3-甲基腺嘌呤（3 - methlyadenine，3- MA）1.5 mg·kg-1·d-1，1 次/d，疗程与艾灸组平行。

1.3 P300电位测定使用丹麦产CounterpointMK2型诱发电位仪捕捉小鼠头皮的长潜伏期电位，通过 Neuroscan Nuamps 脑电记录仪分析及记录电位变化，Scan 4.3信号处理软件离线分析脑电数据。实验中于基线、2周后检测N2潜伏期、P3 潜伏期及P3波幅。正常组及模型组仅于基线时测试。

1.4 数据分析实验结果均采用均值±标准差（）表示，统计结果运用Spss 22.0软件分析，各组数据方差齐时采用两独立样本t检验，方差不齐采用非参数检验；组内治疗前后比较采用配对样本t检验；以P＜0.05记为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前各组事件相关电位比较治疗前正常组与模型组、艾灸组、西药I组、西药II组的N2潜伏期、P3潜伏期、P3波幅相比较差异均有统计学意义（P＜0.05），AD小鼠的N2潜伏期、P3潜伏期均是高于正常小鼠，P3波幅降低；模型组与艾灸组、西药I组、西药II组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 治疗前各组小鼠N2潜伏期、P3潜伏期、P3波幅比较（n=10）

2.2 治疗后各组事件相关电位比较艾灸组与西药I组在治疗后N2潜伏期较治疗前无明显变化（P＞0.05），P3潜伏期较治疗前缩短，P3波幅升高（P＜0.05），说明艾灸督脉与注射雷帕霉素的处理方法均能改善AD小鼠的认识功能；西药II组治疗前后比较N2潜伏期、P3潜伏期、P3波幅均无差异（P＞0.05）；艾灸组与西药I组在治疗后P3潜伏期、P3波幅比较无差异（P＞0.05），说明两者在改善认知功能方面无较大差别。见表2。

表2 治疗后各组小鼠N2潜伏期、P3潜伏期、P3波幅比较（n=10）

3 讨论

阿尔茨海默病主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、日常生活能力的逐渐下降，调查显示60岁以上的老人随着年龄的增长，每往后年长5岁，老年痴呆患者的百分数将上升2倍，65岁以上老人患老年痴呆的概率是13 %，而85岁以上的老人患该病的概率达到45 %［3］。在古代文献中，本病多记载为“健忘”“痴呆”，其病机关键是本虚标实、虚实夹杂，多为心、肝、脾、肾等脏腑亏损，运化无力使水湿、痰瘀停结，阻滞脑络，使清空受扰，神机失用而致痴呆。中医治疗根据“髓海不足”“气血亏虚”等虚证分型，“痰浊蒙窍”“瘀血内阻”“心肝火旺”等实证分型各有治则治法。西医学目前普遍认为AD的发生与Aβ生成与清除机制失衡使Aβ沉积过多形成的细胞外老年斑息息相关，除此还认为过度磷酸化的Tau蛋白也能影响神经元及突触的正常功能［4］。在现代医学治疗中尚无特效药物可治愈或有效逆转疾病进程，但可一定程度上减轻症状及延缓病情发展。在改善认知功能上常用乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-门冬氨酸受体拮抗剂，并结合抗抑郁和抗精神病药物来控制精神症状的发生。在中医学的治疗探索中，经现代研究证明针刺在减少Aβ沉积、抑制Tau蛋白过度磷酸化、促进中枢神经传递等方面的具有一定作用，可改善认知功能［5］。

ERP现在研究较多的是P300电位，按性质特性归属为内源性成分，因其不易受外界刺激的物理特性影响，与认知关系最密切，也被称为“认知电位”。P300与特定的认知活动相关，其敏感性和客观性较神经心理学更高，可以反应语言、记忆、执行功能域的损害。P300的潜伏期反映了大脑对外界刺激的反映速度，难度大时反应速度相应增加；P300波幅表明大脑对信息加工时所匹配的有效资源的程度［6］。据研究表明在痴呆的早期阶段，P300较量表而言更能准确识别疾病的发生，同时也能区分与痴呆临床表现相似的假性痴呆患者，且对认知功能药物的疗效也能做出可靠的评估，可作为临床评估认知功能的一种有效工具［7］。

本实验中艾灸组小鼠取穴“百会”“天门（风府）”“大椎”，三穴选取思路来源于国家级名老中医蔡圣朝主任医师学术思想，认为治疗痴呆应从从“神-脑-督脉-肾-任脉”轴入手［8］。在治疗痴呆时应重视督脉取穴：脑为元神之府，督脉“入络脑”，如张锡纯所言“督脉者，脑髓神经之所也”，调节督脉可起到安神定志的作用；督脉为“阳脉之海”，任脉为“阴脉之海”，二者均起于胞中，为肾所主，上连与神明之府，在针刺督脉时易于调动任脉之经气共同作用于脑；且肾“主骨生髓”，脑为“髓海”，督脉之别络贯脊属肾，肾充则髓充，从而补益于脑。督脉将脑、肾、任脉联系起来共同作用来补益脑髓、调控神志的作用。百会穴为督脉要穴，《灸法秘传》曰：“忘前失后，曰健忘也……病因虽异，皆当灸百会一穴而记忆自强矣。”隔附子饼具有培元固本，益气升阳作用，与百会共奏益脑之效。大椎、风府，配合百会取“腧穴所在，主治所在”之意，温和灸辅之，三穴同用，加强醒脑开窍的作用。现代实验研究认为AD大鼠海马CA1区神经元体积缩小，数量减少，而艾灸疗法能改善海马神经细胞水肿，促进海马神经细胞修复，改善大鼠学习记忆障碍［9］。而且在造模前对大鼠进行艾灸预刺激的研究中也认为预艾灸组在与模型组大鼠比较中能改善减少大鼠脑内cyclin A 和 cyclinB 阳性细胞数，从而缓解AD的病理改变［10］。在本实验的前期研究结果显示艾灸督脉改善小鼠认知功能的作用机制与提升小鼠脑内的细胞自噬水平有关，可改善因Aβ聚集形成的老年斑及神经细胞毒性所导致的脑损伤，有效的阻断Aβ过度表达引发的炎性反应级联效应，从而改善小鼠的学习记忆障碍［11］。

本实验中艾灸组小鼠隔附子饼灸“百会”，温和灸“天门（风府）”“大椎”，西药I组用雷帕霉素腹腔注射给药，西药II组在艾灸组治疗同时予以3-甲基腺嘌呤腹腔注射给药；正常组和模型组动物常规饲养，不予特殊处理，仅进行治疗前的P300测定。结果显示治疗前正常组与模型组相比较：AD小鼠的N2潜伏期、P3潜伏期延长，P3波幅则是较之更低，表明了AD小鼠认知功能的下降，此结果与大多数学者对AD患者的研究结果是一致的［12-14］。而艾灸组在治疗后在P300的测定中表现为P3潜伏期缩短，P3波幅上升，说明艾灸对改善小鼠的认知功能有作用。在西药I组中雷帕霉素作为新型的大环内酯类免疫抑制剂，具有高效免疫抑制作用，其通过增强自噬功能，显著减少脑内异常蛋白质聚集体，维持脑内功能物质的动态平衡，从而抑制神经变性过程的发生来保护脑功能［15］，在P300的测定结果中与艾灸组结果相似，间接能推测艾灸发挥作用于诱导自噬有关。而3-MA作为经典的自噬抑制剂，具有抑制细胞自噬激活的作用［16］，在艾灸的同时采用3-MA腹腔注射治疗，两相作用使艾灸自噬功能降低，从而P300测定表现为治疗前后P3潜伏期与P3波幅无明显改变。

总的来说，艾灸对阿尔茨海默病的作用机理逐渐明朗，临床运用也越来越多。运用P300事件相关电位对疾病进行筛查及预后判断的研究也逐渐丰富，研究认为在P300测定时发现阿尔茨海默病可与MCI、额颞叶痴呆、血管性痴呆相区别，说明P300在认知功能障碍患者诊断中对可以作为AD早期诊断的敏感性较高［17-19］。因此在临床中可逐渐推广P300电位研究，从而减少量表评估的单一性。本实验艾灸组与雷帕霉素组在治疗后测定P300显示能有效缩短AD小鼠P3潜伏期、升高P3波幅，说明艾灸督脉与使用自噬剂雷帕霉素均能改善小鼠认知功能。但本实验同样存在样本量不足的缺点，有待在今后实验中改进。