基于网络药理学探讨华蟾素抗肿瘤的作用机制

★ 罗飞凤 侯恩存 郑景辉 唐友明 吴竞 熊佳惠 卢岳虹（.广西中医药大学研究生院 南宁 53000；.广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 5300）

华蟾素（Cinobufotalin）为我国传统中药中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等干皮提炼出的有效成分。蟾蜍作为药物治疗疾病由来已久，其药性理论记载，首见于我国第一部药物学专著《神农本草经》“蝦蟆，味辛、寒，主邪气，破癥坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病”。蟾皮单独入药，始见于《木经逢原》“蟾皮，辛、凉，微毒”。“蟾蜍”之名，首见于《名医别录》，陶弘景注云，螟蟆“一名蟾蜍”。蟾蜍药性辛、凉，归心、肝、脾、肺经。当代本草学巨著《中华本草》记载：蟾蜍“味辛、性凉，有毒。归心、肝、脾、肺经”，能“解毒散结，消积利水，杀虫消疳。主治痈疽、疗疮、发背、瘰疬、恶疮、癥瘕癖积、臌胀、水肿、小儿疳积、破伤风、慢性咳喘”，并进一步指出“蟾蜍还被应用于肿瘤治疗，对胃癌、食管癌、膀肤癌、肝癌、白血病有一定疗效”。现代药理学研究发现华蟾素的主要生物活性成分为蟾毒内酸类，如蟾酥毒素、脂蟾蜍配基、华蟾素毒基等［1］。华蟾素因其具有低毒、高效，并且对多种肿瘤都具有良好的治疗效果而受到国内外研究人员的广泛关注。

网络药理学以系统生物学和多向药理学为理论基础，构建“成分-靶点-通路-疾病”之间的网络关系探讨药物的作用机制［2］。本研究使用网络药理学方法，以多成分-多靶点-多通路调控的思维为基础，通过构建“成分-靶点-通路-”网络研究华蟾素对肿瘤的作用机制，为临床工作提供一定的指导依据。

1 材料和方法

1.1 数据库检索本研究涉及到的数据库包括：Drugbank（www.drugbank.ca/）；Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；CTD（http：//ctdbase.org/）；uniprot（https：//www.uniprot.org/）；STRING（https：//string-db.org/）；Omicshare（http：//www.omicshare.com/）；cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）。

1.2 华蟾素药物活性成分及相关蛋白的收集在CTD（http：//ctd.mdibl.org/)、Drugbank（www.drugbank.ca/） 以 及Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库，并筛选出符合条件的药物活性成分，并收集合并去重。再通过CTD（http：//ctdbase.org/）数 据 库、OMIM（http：//www.omim.org/）数据库输入相关检索式检索得到华蟾素药物活性成分的相关蛋白，即该药物的潜在抗肿瘤靶点。

1.3 制作华蟾素药物活性成分蛋白互作网络图将1.2中收集到的相关蛋白利用STRING（https：//stringdb.org/）在线平台制作蛋白互作网络图，并以tsv格式导入cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）对该蛋白互作图进行可视化处理及分析。

1.4 华蟾素抗肿瘤相关通路图为了解华蟾素发挥抗肿瘤功效的作用机理，利用京都基因与基因组百科全书（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http：//www.genome. jp/kegg/）通路数据库以及KOBAS3.0平台软件制作通路图，并筛选出具有抗肿瘤作用的相关通路，然后进行通路注释和分析。

1.5 制作成分-靶点-通路图将上述步骤中得到的药物活性成分、相关蛋白靶点以及信号通路共同 导 入cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）软件，以节点（node）表示成分、靶点和通路，边（edge）表示两者之间的相互作用，构建并绘制出成分-靶点-通路网络关系图。

2 结果

2.1 华蟾素药物活性成分及相关蛋白靶点的收集结果 通过CTD数据库搜索关键词“Cinobufotalin”，并将Drugbank、Batman数据库的搜索结果进一步筛选合并，得到华蟾素药物活性成分共30个，再利用CTD数据库进一步预测出华蟾素潜在抗肿瘤相关靶点蛋白，BAX、BID、CASP2、CASP3、CASP8、CASP9、FAS共7个。成分及蛋白靶点，见表1。

表1 华蟾素药物活性成分及相关蛋白靶点

2.2 华蟾素抗肿瘤相关蛋白互作网络图构建及分析为进一步说明华蟾素相关蛋白靶点的相互作用机制，通过STRING在线平台，设定为人源相关性（Homo sapiens），导入上述相关蛋白靶点制作蛋白-蛋白相互作用网络图。然后利用cytoscape3.7.0软件对该网络互作图进行可视化处理和分析。分析结果显示，蛋白互作网络图中共有7个 节 点（Node），BAX、BID、CASP2、CASP3、CASP8、CASP9以及FAS，即7个相关蛋白靶点，有42条边（Edge），即42条相互作用关系，发现各相关蛋白靶点之间均具有紧密的联系，见图1。

图1 华蟾素相关蛋白靶点互作网络图

2.3 华蟾素抗肿瘤相关通路图制作与分析将上述7个相关蛋白靶点导入KOBAS3.0在线平台软件，即可得出华蟾素相关KEGG通路信息，进一步筛选出具有抗肿瘤作用的生物信号通路，见表2。结果显示华蟾素潜在抗肿瘤相关通路共计15条，主要涉及p53信号通路、癌症通路、结直肠癌信号通路、非小细胞肺癌信号通路、前列腺癌信号通路、血管内皮生长因子信号通路等。其中，有6个蛋白靶点作用于p53信号通路（p53 signaling pathway）、6个蛋白靶点作用于癌症通路（Pathways in cancer），另外，有3个蛋白靶点作用于结直肠癌信号通路（Colorectal cancer signaling pathway），见图2。

图2 各通路图

表2 华蟾素抗肿瘤相关通路信息

利用Omicshare分析平台制作高级气泡图，图中气泡从绿色到红色表示P由大到小，气泡面积大小反应基因数量的多少。由富集分析结果可知，共有15条与肿瘤相关的KEGG通路，其中，富集程度最高的前三条通路分别是p53信号通路（p53 signaling pathway）、结直肠癌信号通路（Colorectal cancer signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）。见图3。

图3 华蟾素抗肿瘤作用相关信号通路的高级气泡图

2.4 华蟾素的“成分-靶点-通路”图构建与分析将上述步骤中收集到的华蟾素药物活性成分、蛋白靶点以及相关肿瘤信号通路信息，共同列入Excel表格，并设定对应关系及属性，分别导入cytoscape3.7.0软件制作“成分-靶点-通路”图，根据网络拓扑学性质，选取度值（Degree）较高药物活性成分节点（Node）进行分析，连线（Edge）较多的节点在该网络中可能起到主要抗肿瘤作用，利用 Network Analyzer插件对结果进行分析。分析结果显示，节点连线数量最多，即起到关键作用的蛋白靶点是促细胞凋亡蛋白BAX（Degree 17）,另外，p53信号通路（p53 signaling pathway，Degree 4）是最主要的肿瘤相关通路。所得结果见图4。

图4 “成分-靶点-通路”网络关系图

3 讨论

网络药理学是通过网络数据库进行的网络构建及分析来预测不同节点关联性的一门学科。其打破了“一个药物、一个靶点、一种疾病”的传统理念，为中药多成分、多靶点、多途径效应研究提供了可量化的数据，有助于实现单味药多成分或复方药作用机制的整体化、系统化探索［3］。此次研究基于网络药理学对华蟾素有效成分抗肿瘤的作用机制进行了探讨。

华蟾素成分、作用机制较复杂。本研究通过网络药理学方法，筛选出华蟾素中 30 个活性成分和 7个相关蛋白靶点。此次研究中，从KEGG通路注释图分析结果显示，与华蟾素有效成分抗肿瘤的潜在作用靶点相关的信号通路共有15条，其中，富集程度最高的前三条通路分别是p53信号通路（p53 signaling pathway）、结直肠癌信号通路（Colorectal cancer signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）。血管内皮生长因子信号通路与细胞的增殖与凋亡有关［4-7］；非小细胞肺癌信号通路与内分泌调节有关［8-9］等。张应龙［10-13］等研究表明，p53信号通路可作用DNA损伤修复的多个过程，激活后可调控细胞凋亡及细胞周期。本研究网络分析和核心靶点分析结果显示，华蟾素有效成分抗肿瘤的作用主要与细胞的增殖与凋亡、内分泌调节、调控细胞凋亡及细胞周期等靶点密切相关。

综上所诉，本研究借助网络药理学的研究方法，对华蟾素抗肿瘤的多成分、多靶点、多途径的潜在作用机制进行了分析。结果表明，华蟾素有效成分可能通过血管内皮生长因子信号通路、非小细胞肺癌信号通路、p53信号通路、结直肠癌信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等作用于相应靶点，进而发挥抗肿瘤的作用，为华蟾素防治肿瘤的开发利用提供了一定的参考依据。但由于网络药理学主要依赖现有文献和生物数据库及在药物有效成分及作用靶点的分布差异等生物网络分析和定量检测方面还有所欠缺［14-15］，所以可用数据源具有一定的局限性和一定的片面性，研究结果有待进一步探讨。