基于网络药理学对生姜药用活性成分的发现和作用机制分析

★ 雷丹 洪滔 伍庆华 罗小泉,4 陈来,4 刘志勇,4（.江西中医药大学实验动物科技中心 南昌 0004；.江西中医药大学临床医学院 南昌 0004；.江西中医药大学中医学院 南昌 0004；4.江西省中药药理学重点实验室 南昌 0004）

生姜（Zingiberofficinale Roscoe）属于姜科多年生草本植物姜的新鲜根状茎部分，是人们喜欢用的调味品或菜肴，具有温中止呕、温肺止咳、发散风寒等功效［1］，现在被列为药食两用的中药材。化学成分分析显示生姜中有多达100余种化学成分，分属挥发油、姜辣素、二苯基庚烷三大类［2］。国内外研究表明，生姜的主要药理作用有止吐、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗炎等［3-5］。近年来，网络药理学分析技术的出现，应用文本挖掘等方法建立生物信息关系网络，解析网络拓扑结构并进行中药作用的多靶点预测，为新药研发提供新思路［6-9］。在综合中药系统药理学解析平台（TCMSP）和batman数据库的基础上，应用网络药理学的分析技术对生姜的主要功能物质进行细分，并结合功能成分分析作用靶点、有关生物信号路径和疾病信息，研究了生姜的主要活性成分的功能及其发挥药理作用的机制，为生姜的深入开发和多层次应用提供了科学依据。

1 资料获得与方法

1.1 数据库与处理软件［10-16］数据库（中药系统药理学分析与TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；BATMAN-TCM线上解析数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；UniProt蛋白质通用数据库（http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；CTD数 据库（http://ctdbase.org/）；蛋白质互作平台STRING V 10.5（https：//string-db.org/）；生物学信息注释数 据 库DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）；cytoscape 3.7.2作图软件。

1.2 主要活性成分的收集和靶点获取本研究通 过 检 索TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，中药系统药理数据库和分析平台）相关信息，对获得的生姜所有活性成分数据库进行了筛分选择，其中筛分条件为：经口服药的生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30 %、药物相似的类药性（drug-likeness，DL）≥0.18［10］；其中OB一般认为是评价药物是否发挥药效的一个参考指标［17］，DL代表发现成分与已知西药的相似度，对确定中药成分是否在机体产生作用具有重要参考意义［18］。采用 TCMSP 靶点预测模型对相关活性功能成分作用靶点加以预测,通过UniProt数据库获取有关作用点的DNA片段（基因）名称。利用相关软件建立生姜“活性功能成分-作用点”的关系图，用互联的拓扑学技术分析关系图，并探讨其主要功能活性物质成分与作用点之间的关联。

1.3 作用靶点-相关疾病网络的构建将生姜主要功能物质作用点的关联基因导入到CTD数据线上解析平台（tp：//ctdbase.org/）数据库，得到与作用点有关的疾病信息，解析生姜在疾病治疗中的作用，同时结合已发表的文献研究生姜治疗的主要疾病，选择分析软件Cytoscape 3.7.2（该软件具有网络拓扑属性）软件建立生姜作用点-疾病信息的关联。在该关系结构中，代表靶作用的蛋白以节点表示，代表作用点的相互作用则以“边”来表示。采用网络分析功能，分析网络的拓扑属性，计算其“介数中心性（Betweennesscentrali-ty）”和“节点度值分布（Node de-greedistribution）” 参数［19-20］（节点度值反映了一个靶作用蛋白与其他靶作用蛋白的连接的多少，而介数则是经过这一靶蛋白的路径占最短路径总数的比，度值和介数是量化指标，用以评价一个靶蛋白（节点）在网络中的重要性，具有高的度值和介数值节点可以成为后续新药的发现和靶点预测提供线索），故此最后利用该属性分析来寻找生姜发挥药效作用的主要功能成分。

1.4 相关靶蛋白相互作用网络的建构为研究生姜主要活性功能成分有关靶作用蛋白之间的联系，在STRING平台上建立其相互作用靶蛋白之间的PPI网络。在运行前需要进行有关设置，首先需要将物种设为人类（Homo sapiens），其次要将最低相互作用阀值设为中等置信度（Medium confidence），一般为0.4，其余参数的设置保持默认就可以了，然后通过软件对PPI网络进行拓扑属性进行研究，继而筛选并讨论PPI网络中的关键靶作用蛋白。

1.5 生物过程和通路分析基于上述结果，通过生物学信息注释数据库DAVID 6.8，筛选出最多富集的生物学注释。对生姜主要活性功能成分的靶基因采用KEGG数据库进行路径和基因本体GO的相关生物过程富集，以分析生姜主要活性功能成分作用点的主要代谢路径及GO生物过程（结果中如P＜0.05则判为具有关联性）。

2 结果

2.1 生姜化学成分筛选通过TCMSP数据库筛选潜在的活性化合物，共获得生姜的化学成分共265个，对其在体内的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程中的性质进行评价，最终以OB≥30%和DL≥0.18作为化合物筛分选择的条件，结合CNKI文献报道，共获得10个活性功能成分，如豆甾醇、β-谷甾醇、6-姜酚、6-姜烯酚等。把靶点名称输入UniProt数据库，获得其相应人源靶点的基因名称。其中二氢辣椒碱（Dihydrocapsaicin）、8-姜酚（8-gingerol）未在TCMSP平台上查到相关作用靶点信息，因此共获得生姜的主要活性功能成分8个，如表1所示。

表1 生姜主要活性成分基本信息

2.2 “活性功能成分-作用靶点”网络图分析将筛分出的8个活性功能成分和其相互作用的靶点通过软件构建成网络图，如图1所示。图1包含82个节点（8个活性功能成分和74个相关作用靶点）和119条线，功能活性成分以圆图标表示，相关作用靶点以三角形表示，活性功能成分与相关靶点之间的关系则以线条来表示。目前普遍认为度值和节点与活性功能成分的重要性呈正相关性的关系，值越大，相应的节点在活性成分靶点网络图中越重要［21］。图1中，MOL000358（β-谷甾醇）的度值为38，表明这个活性功能成分的靶点共有38个，最大。MOL000449（豆甾醇）度值为31，MOL002467（6-姜酚）的度值为26，靶点较多的成分提示其在生姜的药理作用中就可能起到关键作用。生姜在越来越多的研究中显示具有抗炎、抗肿瘤等广泛生理活性［22-23］；β-谷甾醇、豆甾醇对人肝癌细胞活性具有明显的增殖抑制作用生姜挥发油研究进展，6-姜酚对人乳腺癌细胞迁移有明显的抑制作用；生姜主要活性成分中MOL001771（B-谷甾醇）的度值为2，最低，可见，不同活性功能成分的作用靶点数量是不一样，作用靶点的差异体现了其发挥药理作用的强度不一样。相关靶点ADRA1B、SCN5A、ADRB2、CHRM1的度值均为4，说明这些可能是生姜发挥整体药效的关键靶点，作用靶点与多个有效成分具有相互作用关系，表明生姜发挥其药理作用是多靶点协同作用的结果。

图1 活性成分-靶点图

2.3 “成份靶点-疾病”网络图分析通过CTD在线分析平台分析成份与靶点有关的疾病， ACHE、BCL2L1、GBRA2、GBRA3、GBRA5、LACTBL1暂 时没有找到相关的疾病信息，删除这部分作用点，共获得65个与疾病相关的点。通过软件构建“成份作用靶点 - 疾病”网络图，包含65个靶作用点和34种相关疾病，共99个节点和2 271条线。图中“V”代表相关疾病，相关靶点以方形图代表， “线”代表活性功能成分与疾病靶点的关系，如图2所示。34种有关疾病包括肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等。“成份作用靶点-疾病”网络图中度值较大的疾病包括肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、血管疾病等，表明生姜的主要活性成分可能有利于治疗肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病等都有作用。其度值较大的靶作用点有PTGS2等，与其相关的疾病分别有41、40、40、39个，表明这些靶作用点在生姜治疗的疾病中可以发挥比较大的作用，也体现了生姜治疗疾病的多成分、多靶点的协同作用的特性。

图2 靶点-疾病图

2.4 靶作用蛋白PPI网络分析生姜靶蛋白PPI联系图显示有63个交汇节点（6个靶蛋白未参与蛋白的相互作用分析）、反应作用连线300条。经计算，PPI 联系图中度值平均为10.526，介数平均为0.025。进一步把度值、介数都排序在前1/3的作用蛋白（排名前19的作用蛋白）建立交集，区分出度值高、介数大的作用蛋白共有9个，提示这些作用靶蛋白是生姜发挥治疗作用的PPI关系网络中的关键靶作用点，在该关系图中发挥了关键作用。关键作用点及拓扑参数见表2。

表2 生姜靶蛋白PPI关系图中的关键作用点及其拓扑参数

2.5 代谢通路 KEGG分析生姜主要功能功能成分中67个作用基因中有59个富集在KEGG代谢通路中，牵涉74条KEGG代谢通路，其中P≤0.05 的信号通路有65条，将相关性排序前十的生物功能如表3所示。基因数目较多的主要代谢通路有：癌症信号通路、尿液配体-受体相互作用、乙型肝炎、Ca2+信号通路、癌中的蛋白聚糖代谢、3K-Akt信号通路、酒精性脂肪肝病（NAFLD）、MP信号通路、视光、直肠癌、吗啡成瘾、可卡因成瘾、甲状腺激素信号通路、心肌细胞中的神经信号、PK信号通路，另有P＞0.05的茶碱和其他因子调节的钙重吸收、ll样受体信号通路、子宫癌、卵母细胞跨内皮迁移、D样受体信号通路、Tural杀伤细胞介导的细胞毒性、花生四烯酸代谢等信号通路,但这些通路在其他文献中报道也与生姜治疗疾病的过程有关。由此可见，生姜具有通过调节多条代谢通路的能力进而发挥治疗疾病的作用。

表3 生姜主要活性功能成分代谢通路与相关靶基因

2.6 GO生物过程分析将上述得到的74个靶点输入到DAVID数据库中，通过生物学功能富集以分析其生物学过程。共得到212条生物过程，其中有显著差异的生物过程共有159条，将排序前十的相关性生物功能列入表4所示。GO分析生姜相关靶点的生物学功能分布发现，主要影响的生物过程有与药物反应、AC激活肾上腺素能受体信号通路、神经元凋亡过程的正调控、与雌二醇反应、突触传递（胆碱能）、平滑肌收缩的正调控、AC抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C激活G蛋白偶联的乙酰胆碱受体信号通路、与脂多糖反应、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路等。

表4 生姜主要活性成分GO生物过程与靶基因

3 讨论

网络药理学能在一定程度上反映生物大分子与化学成分之间的相互作用,通过网络药理学方法筛选出中药更有效的活性成分,能够为更有针对性的中药研究提供基础［25］。生姜是一种姜科药食两用的中药,具有具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳等功效,临床常用于治疗治风湿痛、腰腿痛，胃、十二指肠溃疡，疟疾，急性细菌性痢疾，急性睾丸炎等，还具有止吐、抗肿瘤、抗氧、抗菌、抗过敏、调节免疫系统的作用［1］。为进一步阐述中药生姜的药理作用及其作用机制,借助TCSMP分析平台,以ADME的参数OB、DL为阈值,筛选出生姜中具有较好OB、DL的优效化合物,并构建了化合物-靶点网络,探索生姜的优效化合物与靶点之间的关系,并对靶点进行了基因水平的功能注释。为生姜的优效化合物所对应的多靶点、多途径的药理作用机制提供了研究基础。

生姜的成分复杂,通过筛选得出的分子靶标可能是生姜发挥药理机制的关键物质基础。研究证实，生姜的主要活性成分6-姜酚和6-姜烯酚可以通过不同的机制触发胃癌肿瘤细胞的凋亡［26］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）是植物甾醇类成分之一，存在于某些植物药中，具有降血脂、抗癌、抗炎症等作用，目前β-谷甾醇已应用到医药行业中［27］。且β-谷甾醇、豆甾醇（Stigmasterol）还被研究表明具有抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用［28］。姜酮（zingerone）是生姜及其制品中清除自由基的一种有效成分［29］。10-姜酚（10-gingerol）能剂量依赖性的抑制肝癌HepG2细胞的增殖，抑制Src及其下游的STAT3的激活［30］。说明生姜的优效成分筛选方法的可行性，且生姜可通过这些优效成分从而治疗如癌症、炎症、心血管等疾病及发挥抗氧化作用。

化合物-靶点网络中的靶点共有65个与疾病有关,进一步将生姜的靶点进行PPI分析得到9个关键靶点,包括TP53、CASP3、JUN、MMP9、RELA、PPARG、HSP90AA1、ACHE、MAOA等。提示生姜可能通过优效化合物与筛选出的关键靶点相互作用从而对疾病起到治疗作用。TP53，也称p53，通过调节凋亡、细胞生长，影响肿瘤血管的生成等过程发挥抗癌的作用，并在基因组稳定性中起作用［31］。CASP3（Caspase 3）是一种蛋白质编码基因，CASP3被发现对于正常的大脑发育是必需的，并且在细胞凋亡中也起着典型的作用，它负责染色质的浓缩和DNA片段化［32］。JUN是一种蛋白质编码基因，相关疾病有百日咳和肉瘤，途径包括ATM途径以及理化特性与毒性相关途径，其编码的蛋白c-jun，水平的周期性变化在腺上皮细胞的增殖和凋亡中具有重要意义［33］。MMP9（Matrix Metallopeptidase 9）为MMP家 族的一员，MMP家族是一类金属蛋白酶是钙依赖性锌含内肽酶，其在正常的生理过程中参与细胞外基质的分解，例如胚胎发育、繁殖、血管生成、骨骼发育、伤口愈合、细胞迁移、学习和记忆、以及病理过程如关节炎、脑出血和转移［34-35］。RELA，也称为p65，是一种与REL相关的蛋白，参与NF-κB异二聚体的形成，核易位和激活，已经研究证明RELA可调节免疫应答，并且RELA的活化与多种类型的癌症正相关［36］。PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）是一种蛋白质编码基因，与其相关的疾病包括脂肪营养不良、家族性疾病、颈动脉内膜—中层厚度。HSP90AA1（Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class A Member 1）基因在大多数肿瘤中没有改变,目前发现膀胱癌的改变次数最多,其次是胰腺癌,在许多肿瘤中，HSP90AA1基因是纯合缺失的，这表明这些肿瘤可能具有降低的恶性程度［37-38］。ACHE（Acetylcholinesterase），也称酰水解酶，是体内的主要胆碱酯酶。它是一种酶的是催化的击穿乙酰胆碱和其他一些的胆碱该函数酯作为神经递质，主要存在于神经肌肉接头和胆碱能型化学突触中，其活性可终止突触传递，是神经毒剂和杀虫剂等有机磷化合物抑制的主要靶点。MAO-A是正常大脑功能的关键调节剂。它可通过氧化脱氨作用降解胺类神经递质，例如多巴胺，去甲肾上腺素和5-羟色胺，能够以应对诸如缺血和炎症等应激反应［39］。说明生姜可能是调控这些核心基因或者网络中的其他基因从而调控如癌症、炎症、心血管疾病、行为和神经疾病等。

GO与KEGG分析提示生姜的生物功能主要富集在药物反应、AC激活肾上腺素能受体信号通路、神经元凋亡过程的正调控、与雌二醇反应、突触传递（胆碱能）、平滑肌收缩的正调控的过程。通路主要富集于癌症信号通路、尿液配体-受体相互作用、乙型肝炎、Ca2+信号通路、癌中的蛋白聚糖代谢、3K-Akt信号通路、酒精性脂肪肝病（NAFLD）、PK信号通路等相关通路。其中，癌症信号通路不仅在KEGG为显著性较高的通路，p53和RELA、HSP90AA1等癌症相关蛋白在PPI网络中也处于中心地位，且PPI网络中中心靶点CASP3和MMP9是细胞凋亡和迁移通路的主要蛋白，说明生姜可能是通过调控这些靶点，从而促肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞的迁移等，而起到抗肿瘤的作用。

4 结论

本研究通过网络药理学的技术与方法，描绘了生姜多种功能成分-多作用靶点的网络关系，再次印证了中药起效是通过“多成分、多靶点”作用的特点。同时这个方法可以继续用于虚拟筛选生姜有效物质并发现其作用靶点，进一步阐明生姜活性功能成分、作用靶点、影响通路之间相互作用关系，对于发现生姜及其活性功能成分可以通过多个作用靶点、多条代谢通路发挥药理药效作用，为进一步研究生姜药理药效机制提供理论依据。但我们这次的研究也有不足之处，目前工作仅是基于数据库的分析，通过数据搜集获取的资料对药物的功效进行预测，后续要更深入了解生姜的药效物质还需要设计一些试验加以验证；此次分析的方法,也只是通过OB和DL的筛分为条件,与生姜的实际吸收情况有一定的差距,也存在着一定的限制，因为药物的吸收利用不仅仅局限于口服，而且口服生物利用度低的成分也需要重视起来，恰恰是这些成分可能存在更广泛的治疗作用，但本研究为生姜药用价值的进一步合理开发提供了一个思路。