2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应

李玲玲，沈章军，宋玉芳，史奕

1. 合肥师范学院，合肥 230009 2. 中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳 110016

拟除虫菊酯类农药由于具有高效、对哺乳动物和鸟类低毒、且易降解等优点，已经逐渐成为有机磷、有机氯和氨基甲酸酯类杀虫剂的替代品而被广泛应用于农业生产和公共场所防虫工作中[1]。根据构效学和特征学，拟除虫菊酯类农药被划分为Ⅰ型和Ⅱ型[2-3]。联苯菊酯，一种Ⅰ型拟除虫菊酯类农药，在农业生产中广泛用于防治昆虫和螨虫[4]。氟氯氰菊酯，一种Ⅱ型拟除虫菊酯类农药，广泛应用于农业、兽医业以及家庭住宅中的防虫过程中[5]。随着疏水性拟除虫菊酯类农药的大量使用，它们被土壤颗粒和沉积物强烈吸附，从而对生态系统的结构和功能产生不可逆的损伤[6-9]。

α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-Glu)是一种消化酶，可以参与有机体内碳水化合物的消化并释放葡萄糖，具有被用作生物指标以评估环境中农药暴露引发的生态风险的潜力[10-11]。蛋白酶是另外一类消化酶，已经在赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)体内被发现，其不仅具有水解纤维蛋白和其他蛋白成短肽或自由氨基酸的作用，也具有活化一些酶类的作用，例如凝血素和血纤维蛋白溶酶原[12-13]。前期研究主要关注蚯蚓蛋白酶的临床应用，而将蛋白酶活性作为评估环境污染物风险指标的研究未见报道[12]。消化酶活性与有机体的摄食能力和生长能力息息相关，而在笔者团队前期研究中发现联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下赤子爱胜蚓的体质量增长率被抑制，因此，可以将消化酶作为环境潜在毒性诊断标志物[14-16]。基于以上研究，笔者假设联苯菊酯和氟氯氰菊酯影响了蚯蚓体内消化酶的活性，从而导致其体质量增长率被抑制。

蚯蚓是土壤生态系统中重要的分解者，影响着土壤生态系统中的分解活性、营养矿化和初级生产[17]。蚯蚓通过其行为活动能够改善土壤结构，提高土壤透气、排水和深层持水能力，扮演着“土壤生态系统工程师”的重要角色。生活在土壤生态系统中的蚯蚓摄取大量的土壤，可以通过皮肤和肠道直接接触土壤污染物，已经被经济合作与发展组织(OECD)和国际标准化组织(ISO)推荐为研究化学品对土壤生态系统无脊椎动物影响的模式生物[18-19]。目前，应用蚯蚓诊断生态毒理的研究多集中在污染物暴露对其生存、生长及繁殖等个体水平上的影响。然而，随着生态毒理诊断的发展，蚯蚓个体水平指标已经不能满足低剂量污染条件下的风险评估，随之应运而生的是蚯蚓生物标志物在土壤生态系统风险评估中的应用。

本研究以模式生物赤子爱胜蚓为实验动物，通过探究4种消化酶(α-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)的响应，评估联苯菊酯和氟氯氰菊酯对赤子爱胜蚓的消化毒性效应，从而为进一步评估拟除虫菊酯类农药的土壤生态风险，阐释其毒性机制提供基础实验数据支撑和理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 供试土壤

土壤取自中国科学院沈阳农业生态站保护行0～20 cm土层，该土壤具有以下理化性质：pH 6.2，碱解氮(K-N)0.091%，总磷(TP)0.04%，总钾(TK)0.18%，有机质(OM)1.65%，阳离子交换量(CEC)12.3 cmol·kg-1，最大持水量(WHC)32%。土壤的粒径分布如下：砂粒(>50 μm)占22%，粉粒(1～50 μm)占64%，黏粒(<1 μm)占14%。土壤采集后去除植物等残渣，室温条件下风干，过20目筛后备用。

1.1.2 蚯蚓

赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)购买于沈阳华清源蚯蚓养殖公司，挑选300～400 mg具有健康环带的成蚓在洁净土壤中于(20±1) ℃(光照∶黑暗比为12 h∶12 h)驯化至少2周。

1.1.3 试剂和仪器

试剂：联苯菊酯(97%)和氟氯氰菊酯(95%)购买于上海永远化工有限公司。牛血清蛋白(≥95%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(99.5%)、乙二胺四乙酸(EDTA)(≥99%)、二硫苏糖醇(DTT)(99%)、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(α-pNPG)(≥99.7%)、转化酶(≥300 units·mg-1固体)、酪蛋白(≥98%)和酪氨酸(≥99%)购买于美国西格玛奥德里奇公司，磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、醋酸(HAC)、醋酸钠(NaAc)和硼砂(Borax)等其他试剂均为分析纯，购买于沈阳莱博科贸有限责任公司。

仪器：BS210S万分之一电子分析天平(Sartorius，德国)，HPG-280BX型光照培养箱(哈东联，北京)，HPS-280型光照培养箱(哈东联，北京)，10 mL手动玻璃匀浆器(凯瑞实验器材，江苏)，CP-80MX低温超速离心机(Hitachi，日本)，Multiskan FC-51119000酶标仪(Thermo，美国)，高效液相色谱仪(Thermo Fisher Ultimate 3000，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 污染暴露实验

根据前期急性毒性实验半数致死浓度结果，设置本实验亚致死剂量分别为：联苯菊酯0、10、20、40、60和80 mg·kg-1；氟氯氰菊酯0、5、10、20、30和60 mg·kg-1，暴露期为28 d，其中0 mg·kg-1即为对照组。联苯菊酯和氟氯氰菊酯溶解在50 mL丙酮中，然后撒到土壤中拌匀，平衡48 h以挥发丙酮，调节水分含量至60% WHC。每个浓度有3个重复，每个重复含有2 000 g土壤和40条蚯蚓。

1.2.2 指标测定

分别于暴露第3、7、14、21和28天，从每个重复组中取出3条蚯蚓，放于湿润滤纸上清肠24 h，然后冰块上解剖获取内脏。由于赤子爱胜蚓内脏较少，因此每个重复组中取出的3条蚯蚓内脏合并为一个样品。内脏使用0.15 mol·L-1KCl清洗，然后放于2 mL匀浆缓冲液(包含250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris pH 7.5，1 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA)中进行手动匀浆。匀浆液于4 ℃、15 000×g下离心30 min，取上清液用于测定消化酶活性。

α-Glu活性测定参考Agustí等[20]和Boyd[21]的方法，将80 μL内脏上清液和80 μL的10 mmol·L-1α-pNPG溶液放于96孔板内于37 ℃下孵育反应1 h，而后通过添加80 μL的15% Na2CO3溶液以终止反应，然后放于酶标仪405 nm处测定其吸光度。以转化酶作为标准溶液，α-Glu活性表示为单位质量(mg)蛋白参与反应产生的转化酶的量(U·mg-1protein)。

蛋白酶活性测定采用福林酚法，是在Hidalgo等[22]的方法基础之上略作调整后的方法。酪蛋白作为蛋白酶水解作用的底物，反应缓冲液分别使用0.2 mol·L-1NaAc-0.2 mol·L-1HAC(pH 3.6)，0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4(pH 7.0)和0.05 mol·L-1Borax-0.2 mol·L-1NaOH(pH 10)。100 μL的酪蛋白水溶液(1%)、100 μL内脏上清液和100 μL反应缓冲液，放于40 ℃水浴锅中孵育反应15 min，之后加入300 μL的0.4 mol·L-1三氯乙酸，然后放于4 ℃下静置10 min，以10 000×g离心5 min。取离心后的100 μL上清液，加入500 μL的0.4 mol·L-1Na2CO3溶液和100 μL的福林酚显色液充分混合，放于40 ℃水浴中显色15 min。显色结束后，取200 μL溶液加入96孔板中，放于酶标仪测定溶液于650 nm处的吸光度。酪氨酸溶液作为标准曲线溶液，1 U蛋白酶活性定义为在40 ℃各pH环境下单位时间(min)产生1 μg酪氨酸所需要的酶量(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)。

土壤农药残留量的测定根据张志勇等[23]的方法并加以改进，分别于暴露第3、7、14、21和28天取出联苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒的土壤样品，使用气相色谱(GC)测定土壤中2种拟除虫菊酯类农药的残留量，该部分数据已发表[15-16]。

1.3 数据统计与分析

使用SPSS 21.0进行数据分析，数据均以平均值±标准差表示，Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验用于正态分布和方差齐性检验。使用Dunnett多重检验比较各暴露时间下拟除虫菊酯类农药处理组与对照组之间的显著性差异。如果数据不能满足匀质性，使用对数转换，如果转换数据后依然不满足方差齐性，则使用Kruskal-Wallis H非参数检验进行数据分析。图形使用SigmaPlot 12.5制作。

2 结果(Results)

2.1 联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓α-Glu活性的响应

如图1所示，在暴露初期第3天时，20～80 mg·kg-1联苯菊酯处理组中蚯蚓α-Glu活性增加，说明在早期联苯菊酯能够诱导消化酶α-Glu的水解作用。随着时间延长，在暴露第7、14和28天，高剂量联苯菊酯(60～80 mg·kg-1)对α-Glu活性起到抑制作用，即消化酶α-Glu的水解作用在长时间的高剂量组暴露下被干扰。如图2所示，在暴露21 d内，除第14天外，其他暴露时间下，氟氯氰菊酯能够显著抑制蚯蚓体内的α-Glu活性。在暴露第28天下，氟氯氰菊酯处理组蚯蚓α-Glu活性与对照组无显著差异。2种拟除虫菊酯类农药暴露下，蚯蚓α-Glu活性对氟氯氰菊酯的响应更为敏感。

图1 联苯菊酯暴露下蚯蚓体内α-葡萄糖苷酶活性的变化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；与对照组相比有显著性差异(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 1 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

图2 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓体内α-葡萄糖苷酶活性的变化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；与对照组相比有显著性差异(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 2 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.2 联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓蛋白酶活性的响应

在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓体内3种蛋白酶活性(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)被测定。如图3(a)所示，在暴露初期第3天时，酸性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1联苯菊酯显著诱导。随着暴露时间的延长，诱导作用降低。如图3(b)所示，与对照组相比，在暴露初期第3天时，中性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1联苯菊酯显著诱导，随着暴露时间延长，高剂量组(60～80 mg·kg-1)诱导作用减弱。如图3(c)所示，在暴露第3天，随着浓度的增加，碱性蛋白酶活性增加，在60 mg·kg-1和80 mg·kg-1联苯菊酯处理组达到显著诱导，分别是对照组的1.82倍和1.84倍。同样，随着暴露时间延长，诱导作用逐渐减弱。从响应剂量和显著性分析，3种蛋白酶中中性蛋白酶活性对联苯菊酯暴露的响应更为敏感。由图3可知，3种蛋白酶活性在暴露早期能够显著被联苯菊酯诱导，揭示着它们具有早期生物标志物的潜能。

氟氯氰菊酯暴露下，3种蛋白酶活性的响应情况如图4所示。由图4(a)可知，暴露初期第3天时，低剂量氟氯氰菊酯处理组(5 mg·kg-1)显著诱导了赤子爱胜蚓体内酸性蛋白酶活性，而10～60 mg·kg-1氟氯氰菊酯处理组则抑制了赤子爱胜蚓体内酸性蛋白酶活性。在整个暴露期间内，高剂量氟氯氰菊酯处理组(60 mg·kg-1)对蚯蚓酸性蛋白酶活性起到抑制作用。如图4(b)所示，在第3天，与对照组相比，5 mg·kg-1氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓中性蛋白酶活性有所增加，随着暴露浓度的增加，中性蛋白酶活性有所降低。暴露第7天时，高剂量氟氯氰菊酯(60 mg·kg-1)显著抑制了蚯蚓中性蛋白酶活性，对照组活性是该处理组的1.59倍。到暴露中后期，则出现了诱导作用。由图4(c)可知，氟氯氰菊酯对蚯蚓碱性蛋白酶的显著影响仅仅发生在暴露早期第3天，蚯蚓碱性蛋白酶活性被5 mg·kg-1氟氯氰菊酯显著诱导，被10 ～ 60 mg·kg-1氟氯氰菊酯显著抑制，其中，对照组蚯蚓碱性蛋白酶活性是最高剂量组的1.37倍。随着暴露时间延长，碱性蛋白酶活性在处理组与对照组之间没有显著响应差异。从响应剂量和显著性分析，酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活性对氟氯氰菊酯的早期暴露的响应更为敏感，在暴露后期，中性蛋白酶活性对低剂量氟氯氰菊酯的响应更敏感。由图3和图4结果可知，在联苯菊酯和氟氯氰菊酯早期暴露下3种蛋白酶活性主要呈现出相反的响应趋势。

图3 联苯菊酯暴露下蚯蚓体内酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和碱性蛋白酶(c)活性的变化注：与对照组相比有显著性差异(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 3 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

图4 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓体内酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和碱性蛋白酶(c)活性的变化注：与对照组相比有显著性差异(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 4 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.3 联苯菊酯和氟氯氰菊酯残留量与消化酶活性之间的量效关系

随着暴露时间的延长，联苯菊酯和氟氯氰菊酯被逐渐降解，2种拟除虫菊酯类农药的降解符合一级动力学模式[15-16]。为探究拟除虫菊酯类农药暴露下，蚯蚓体内消化酶活性与土壤残留的拟除虫菊酯类农药之间的量效关系，本研究选用3种曲线拟合拟除虫菊酯类农药残留量与消化酶活性的回归方程，并进行了显著性检验，P<0.05即表示曲线拟合效果较好，具有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

如表1所示，在联苯菊酯暴露下，暴露初期(7 d内)消化系统3种蛋白酶活性与联苯菊酯残留量存在着显著的回归关系；暴露中后期，消化酶α-Glu活性与土壤联苯菊酯残留量之间存在显著的回归关系。如表2所示，在氟氯氰菊酯暴露下，在暴露第7天时，4种消化酶活性与氟氯氰菊酯残留量之间存在较好的拟合方程关系；暴露中期14 d时，仅蚯蚓碱性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量存在显著的回归关系；暴露后期第21天时，仅有酸性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量存在显著的回归关系；最后暴露第28天时，α-Glu活性和碱性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量之间存在显著的回归关系。

表1 土壤中联苯菊酯残留量与蚯蚓体内消化酶活性的量效关系Table 1 Dose-response relationship between bifenthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

表2 土壤中氟氯氰菊酯残留量与蚯蚓体内消化酶活性的量效关系Table 2 Dose-response relationship between cyfluthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

2.4 联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下消化酶活性之间的相关性分析

生物体中各生物标志物之间不是相互独立的，而是存在着互相调节的关系，本研究采用Pearson相关性分析方法分析蚯蚓在2种拟除虫菊酯类农药暴露下，其体内4种消化酶之间的相关性。如图5所示，对照组处理下，蚯蚓α-Glu活性与蛋白酶活性之间相关性不显著，3种蛋白酶活性之间存在显著的两两正相关。如图6和图7所示，在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓消化系统中α-Glu、酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶活性之间呈现两两显著正相关。与对照组比较可以发现，在添加联苯菊酯和氟氯氰菊酯后，α-Glu活性与蛋白酶活性出现显著相关性，说明2种拟除虫菊酯类农药的暴露能够诱导2类不同消化酶之间发生协同作用以应对外界胁迫。

图5 对照组处理中蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson相关性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms in control groupsNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

图6 联苯菊酯暴露下蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson相关性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 6 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

图7 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson相关性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 7 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

3 讨论(Discussion)

蚯蚓消化酶(α-Glu和蛋白酶)与其摄食能力、生物增长相关，然而却很少被用作识别环境污染物的生物标志物。本研究分析了联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露对土壤模式生物赤子爱胜蚓4种消化酶的影响。结果显示，联苯菊酯和氟氯氰菊酯影响了赤子爱胜蚓消化酶的活性，调节了2类不同消化酶之间的协同作用以应对暴露胁迫。

暴露在联苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒土壤下，赤子爱胜蚓体内α-Glu活性的变化表明其体内的糖类水解在一定程度上受到拟除虫菊酯类农药的影响。然而关于α-Glu响应的具体分子机制依然未知，有待进一步研究。蛋白酶水解作用能够调解有机体的发育过程、细胞内稳态和组织修复[24]。然而仅有少量研究以蛋白酶活性为端点进行污染暴露实验，例如花园爱胜蚓(E.hortensis)白细胞溶解产物中的蛋白酶活性在暴露5 d后随着多氯联苯(PCBs)(1～30 μg·cm-2)浓度的增加而增加[25]。本研究中，3种蛋白酶活性在暴露早期，能够分别被联苯菊酯和氟氯氰菊酯显著诱导和抑制，表明它们能够被用作早期警示标志物以评估联苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性效应。研究发现赤子爱胜蚓内脏中的中性和碱性蛋白酶水解活性高于酸性蛋白酶(图3和图4)，这一现象也出现在鲤鱼和丁鲷中[22]。同一个指标在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下出现不同的响应，可能与2种拟除虫菊酯类农药的结构差异有关。相比Ⅰ型联苯菊酯，Ⅱ型氟氯氰菊酯的醇基团α碳上存在一个氰基团[26]。

在整个暴露期间，蚯蚓消化酶与联苯菊酯和氟氯氰菊酯之间的相关性随着时间发生变化，可能因为随着时间延长，2种拟除虫菊酯类农药被蚯蚓及土壤微生物代谢转化，形成一个拟除虫菊酯类农药母体与中间代谢产物复合污染的体系，蚯蚓生化指标的变化是母体和中间产物共同影响的一个结果。例如，联苯菊酯代谢过程中环丙基甲酸和2-甲基3-联苯基甲醇产生，这些代谢产物的毒性可能高于母体化合物[27]。在氟氯氰菊酯的代谢过程中会释放出化学不稳定性的氰醇，氰醇能够分解为氰化物和醛类，而这些化合物是自由基的来源物，可以对有机体造成损伤[28]。

综上所述，亚致死剂量的联苯菊酯和氟氯氰菊酯能够引起赤子爱胜蚓的消化酶活性的紊乱，从而可能影响其生长繁殖。氟氯氰菊酯对α-Glu活性的抑制作用大于联苯菊酯，蛋白酶活性能够在暴露最早期指示联苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性。在2种拟除虫菊酯类农药暴露下，蚯蚓体内4种消化酶之间存在着显著的相关关系。

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