云南三种管鼻蝠形态特征描述及系统发育

张 欣 钟韦凌 吴 毅 黄正澜懿 Gabor CSORBA 刘 硕 王巧燕 权锐昌 李 松* 余文华*

(1.广州大学生命科学学院，广州，510006；2.匈牙利自然博物馆动物部，布达佩斯H-1088，匈牙利；3.中国科学院昆明动物研究所，昆明动物博物馆，昆明，650223；4.西双版纳傣族自治州国家级自然保护区管理局科研所，景洪，666100；5.中国科学院西双版纳热带植物园，勐腊，666303)

管鼻蝠属(Murina)隶属于翼手目(Chiroptera)，蝙蝠科(Vespertilionidae)，是一类鼻孔延长呈管状的森林型蝙蝠，主要分布在亚洲东部、南部及中部地区[1]。由于该类群常栖息于远离人烟的森林环境，飞行灵活，难以捕获，故其本底资料较匮乏[1-3]。近20年来，通过调查强度的逐渐加强，我国管鼻蝠物种已从2007年记录的8种[2]增加至19种，其新发现种类主要集中于华南和西南地区，提示我国是该类群重要的物种分化和形成场所[1，4]。

云南位于我国西南部，其热带雨林区域自然资源丰富，翼手目的丰富度高，是重要的生物多样性热点区域之一[5-6]。该地区蝙蝠资源非常丰富，目前已记录翼手目种类合计7科29属79种，但管鼻蝠属种类仅5种[6-8]，低于相邻国家管鼻蝠的物种数量，如：越南13种、老挝8种、泰国7种和缅甸6种[1]，也低于邻省区，如广西6种、贵州7种[6]，提示云南区域森林型蝙蝠本底调查仍不充分。为进一步摸清云南西双版纳热带植物园哺乳动物(Mammalia)物种多样性状况，于2019年对该园勐腊片区进行哺乳动物物种资源调查，利用蝙蝠竖琴网采集到管鼻蝠15只。通过外形和头骨的形态学特征比较，数值分类学分析及系统发育学等方法，将其鉴定为菲氏管鼻蝠(Murinafeae)、哈氏管鼻蝠(M.harrisoni)和艾氏管鼻蝠(M.eleryi)，其中前2种为云南省的新记录。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2019年4—5月，在中国云南省西双版纳州勐腊县龙林新村(21°32′11″N，101°29′58″E，海拔1 024 m)等地利用蝙蝠竖琴网捕获到管鼻蝠，经鉴定包括3个物种，即菲氏管鼻蝠6只(GZHU 19167、19180、19181、19318、19320、19335)、哈氏管鼻蝠2只(GZHU 19216、19230)和艾氏管鼻蝠7只(GZHU 19168、19206、19210、19236、19311、19313、19314)，以上标本经外形称量、超声波录制、拍照和组织取样(体积分数95%的乙醇保存)后，用体积分数75%的乙醇浸泡，分别保存于广州大学生命科学学院和中国科学院昆明动物博物馆。在形态鉴定及数值分类中，本研究还使用了匈牙利自然博物馆等地馆藏的管鼻蝠标本共92只，标本信息见附录1。

附录1 形态特征比较使用的3种管鼻蝠标本

1.2 标本测量

按照哺乳动物测量标准[4，9-10]对样本测量(TANITA电子称，精确到0.1 g；MNT-150数显游标卡尺，精确到0.01 mm)。外形测量指标为体重(body weight，Wt)、头体长(head and body length，HB)、前臂长(forearm length，FA)、耳长(ear length，E)、后足长(hindfoot length，HF)、胫骨长(tibia length，TIB)、尾长(tail length，T)。头骨测量指标包括颅全长(great length of skull，GTL)、枕犬长(condylo-cannine length，CCL)、脑颅宽(breadth of braincase，BB)、颧宽(zygomatic width，ZW)、眶间宽(interorbital width，IOW)、上齿列长(maxillary tooth length，C1-M3)、上犬齿宽(upper canine width，C1-C1)、上臼齿宽(third molar width，M3-M3)、下齿列长(mandibular toothrow，C1-M3)、下颌长(mandibular length，ML)。

1.3 多元统计分析

对收集的哈氏管鼻蝠、菲氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠标本形态学数据(表1和表2)和本次采集样本的头骨测量数据进行多元统计分析，使用主成分(principal component analysis，PCA)和主成分判别分析(discriminant analysis of principal components，DAPC)方法[11]，对测量数据降维分析。以上分析均在R 4.0.2中进行[12]，使用分析软件包包括：“psych”“ggplot2”“ade4”和“adegenet”[13-16]。

表1 3种管鼻蝠外部形态数据

表2 3种管鼻蝠头骨数据

1.4 系统发育学分析

取约20 mg 肝组织使用DNA试剂盒(AG通用型基因组AG21009，艾科瑞生物)提取总DNA，之后使用PCR方法扩增目的片段，筛选出640 bp左右的线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene，COⅠ)和1 077 bp左右的核基因重组激活基因2(Recombination activating gene 2，Rag2)。线粒体COⅠ基因部分片段的扩增引物为COⅠ-F：5′-ACA GCC TAA TAC CTA CTC GGC CAT T-3′和COⅠ-R：5′-AGG CTC GGG TGT CTA CGT CCA-3′[17]。PCR反应总体系为30.0 μL，其中PremixTaqTM13.0 μL，引物各0.5 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O 13.0 μL。PCR反应程序为94℃预变性240 s；94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，37个循环；最终72℃延伸240 s；4℃保存PCR产物。核基因Rag2基因部分片段的扩增引物为Rag2-F：5′-GTA AGG ATT TCT TGG CAG GAG T-3′和Rag2-R：5′-ATC CTG CCC CAC TGG AGT TTT C-3′[17]，PCR反应总体系为25.0 μL：PremixTaqTM12.5 μL；引物各1.0 μL；模板DNA 3.0 μL；ddH2O 7.5 μL。PCR反应程序为94℃预变性180 s；94℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，共35个循环；最终72℃延伸1 800 s；10℃保存PCR产物。PCR产物送往上海生工生物工程公司测序。

使用GENEIOUS 9.1.8软件[18]对所得序列进行目测校对与拼接比对。结合从NCBI-nt下载的管鼻蝠COⅠ序列(序列GenBank登录号见附录2)和Rag2序列，使用IQ-TREE 1.6.1软件[19]采用最大似然法(ML)构建系统发育树，其中COⅠ和Rag2序列矩阵分别根据BIC选择最适替换模型，分别为TIM2+Г+I+G4和HKY+Г+I，自展1 000次估计节点的支持度。使用MrBayes 3.2[20]进行贝叶斯树构建，使用MrModeltest 2.3[21]确定最佳的DNA替换模型(GTR+Γ+I)，设置参数为：建立4个马尔可夫链，运行1 000万代，采样频率为5 000，丢弃前500 000代后构建一致树。以上分析均以毛翼管鼻蝠(Harpiocephalusharpia)序列为外群。

附录2 图3a COⅠ序列管鼻蝠GenBank登录号

2 结果与分析

本次云南西双版纳热带植物园勐腊片区调查获得的管鼻蝠标本，经外形和分子鉴定后确定分别为菲氏管鼻蝠、哈氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠，其中前2种为云南省蝙蝠新记录物种。

2.1 3种管鼻蝠外形及头骨特征描述

2.1.1 菲氏管鼻蝠——云南省蝙蝠新记录

小型管鼻蝠，前臂长为27.54—31.79 mm，平均为(30.35±1.90)mm(n=6)，鼻部呈短管状向前延伸；耳廓稍平钝无缺刻，内部有点状结构突起；耳屏尖长，约为耳长之半(图1A)。背部呈灰黑色，背毛基部黑色、中部灰色、毛尖灰褐色；腹部整体呈灰白色，胸部及其两侧毛发呈浅褐色调，毛基深灰色，毛尖银白色，胸毛毛尖白灰浅褐色(图1B)。

头骨小，颅全长为15.56—16.14 mm，平均为(15.80±0.20)mm(n=6)，头颅稍膨大，吻突不膨胀，吻侧相对狭窄，头颅中部比前部稍高，眶部有一明显凹陷，矢状嵴和人字嵴不显著，颧弓相对发达。齿式为2.1.2.3/3.1.2.3=34。上颌内门齿(I2)和外门齿(I3)紧密连接且等高；上犬齿(C)略高或等高于第2上前臼齿(P4)，但上犬齿的基部面积小于P4基部面积；第1上前臼齿(P2)矮小，其高度和基部面积约为P4的1/2；3枚上臼齿(M1、M2和M3)均具明显而小的中附尖。下犬齿略高于第2下前臼齿(P4)，其基部面积等于或大于P4；第1下前臼齿P2高度约为P4的2/3，其基部面积不到P4的1/2；下臼齿均具有小且明显的下内尖(图1C)。

2.1.2 哈氏管鼻蝠——云南省蝙蝠新记录

中等体型管鼻蝠，2只，前臂长分别为35.68、36.99 mm，管状鼻孔有缺口，朝外且发达；耳廓中等大小，较狭长；耳屏垂直呈披针形，长度约为耳廓的一半，上端尖长(图1D)。背部和额部的颜色相近，覆盖大量黄褐色毛发，毛发尖端到基部颜色由深到浅，毛尖为黄褐色，毛基为浅黄褐色；腹部为浅褐黄色；腹部毛发毛尖为浅黄褐色，毛基为灰黑色，毛尖与毛基之间颜色渐变，无明显分界线(图1E)。

头骨中等大小，颅全长18.71 mm，头骨外形较平坦，吻突相对较厚，吻突到脑颅均匀升高，具发达的矢状嵴、人字嵴和颧弓，颧弓中部有一隆起。齿式为2.1.2.3/3.1.2.3=34。上犬齿(C)的高度约为第1上前臼齿(P2)的2倍，P2的高度基本与第2上前臼齿(P4)相等；第1上臼齿(M1)和第2上臼齿(M2)具发达的中附尖。下犬齿发达，下臼齿均具发达的下后尖；下颌冠状突较发达(图1F)。

2.1.3 艾氏管鼻蝠

小型管鼻蝠，前臂长为27.75—28.38 mm，平均为(28.11±0.27)mm(n=7)，管状鼻孔前突朝向身体左右两侧；耳廓尖钝圆；耳屏高度约为耳长的一半，锐尖挺直(图1G)。背部整体呈棕色，毛基灰黑色，毛中到毛尖从灰黄色逐渐加深到橙棕色，部分毛尖金黄色且有金属光泽，零散分布在背部、颈背及两侧和头部；腹部整体呈灰白色，毛基黑色，毛尖灰白色，上胸部和腹部两侧浅橘棕色(图1H)。

头骨较小，颅全长为13.97—14.96 mm，平均为(14.63±0.35)mm(n=7)，脑颅前部及中部膨大，眶部有一明显凹陷，矢状嵴缺失，人字嵴不发达；颧弓纤细，不发达。齿式为2.1.2.3/3.1.2.3=34。上犬齿(C)高于第2上前臼齿(P4)，其基部面积小于P4；第1上前臼齿(P2)矮小，远低于P4，前者基部面积不到后者的1/2；上臼齿(M1和M2)具发达中附尖。下犬齿高于第2下前臼齿(P4)，其基部面积等于或稍大于P4；第1下前臼齿P2较小，其齿冠面积约为P4的1/2，高度约为P4的2/3(图1I)。

2.2 3种管鼻蝠头骨指标的数值分类

对国内外及本研究合计107份标本的10项头骨指标进行主成分分析。结果显示，前两个主成分占总体信息的93%，其中主成分1(PC1)为77%，主成分2(PC2)为16%(图2A)。PC1与除眶间宽(IOW)外测量指标存在较高的正相关，集中反映出头骨数据的整体大小效应，将哈氏管鼻蝠从三者中区分开；PC2则与头骨数据中的眶间宽相关(表3)。但对于同属于“suilla-type”的艾氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠[25]，主成分分析散点图无法将两者明显区分开(图2A)。主成分判别分析(DAPC)的结果与PCA类似，前两个判别函数可解释总体变异的96.3%。其中颧宽和下颌长对判别值1(DF1，量符号为DF1)具较高的贡献度，颅全长和下颌长对于判别值2(DF2)有大的贡献度(表3)。在DAPC中艾氏管鼻蝠与菲氏管鼻蝠虽无法明显区分，但前者主要集中在左侧(DF1<-3)而后者主要集中在右侧(-5

表3 基于头骨度量数据的主成分(PCs)中的变量载荷和判别函数(DFs)中原始变量的贡献度

2.3 3种管鼻蝠系统发育

基于COⅠ序列构建的ML和贝叶斯树均显示，GZHU 19168、19206、19210、19236、19311、19313、19314与NCBI-nt中艾氏管鼻蝠聚为高支持度的一支(自展值100，后验概率1.0；图3A)；GZHU 19216、19230与NCBI-nt中哈氏管鼻蝠聚为一支(自展值100，后验概率1.0；图3A)；GZHU 19167、19180、19181、19318、19320、19335与NCBI-nt中菲氏管鼻蝠聚为一支(自展值100，后验概率1.0；图3A)。基于Rag2序列构建的ML和贝叶斯树与基于COⅠ序列支系结果一致(图3B)。

2.4 云南管鼻蝠的物种多样性

随着云南省翼手类调查和研究的逐步深化，蝙蝠科管鼻蝠属物种丰富度逐渐显现。云南省原有金管鼻蝠(M.aurata)[26]、白腹管鼻蝠(M.leucogaster)[6]、罗蕾莱管鼻蝠(M.lorelieae)[27]3种记录，近期西双版纳还报道了艾氏管鼻蝠、圆耳管鼻蝠2种云南新分布[7-8]，现又新增本研究哈氏管鼻蝠、菲氏管鼻蝠2种管鼻蝠新发现，故云南省现有管鼻蝠7种，其中西双版纳分布有圆耳管鼻蝠、艾氏管鼻蝠、哈氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠4种，说明该地区的管鼻蝠物种资源丰富。

上述7种管鼻蝠中，由《中国脊椎动物红色名录》[28]列为近危(NT)等级的有金管鼻蝠等3种(表4)，列为无危(LC)等级的有1种，列为数据缺乏(DD)等级的2种，菲氏管鼻蝠尚未列入。而根据IUCN(2020年)名录，列为无危(LC)等级的有白腹管鼻蝠等4种，列为数据缺乏(DD)等级的有2种，艾氏管鼻蝠尚未列入。

表4 云南管鼻蝠的标本采集及濒危情况

3 讨论

菲氏管鼻蝠在18世纪后叶被命名[29]，随后在越南、老挝、中国等地区有分布报道[25，30]，至今该种在国内分布于广西、贵州、广东和江西[22，30]。哈氏管鼻蝠为Csorba等[31]于2005年依据柬埔寨标本命名的新种，随后在缅甸、泰国、越南和柬埔寨均报道有分布[1]，国内分布包括海南、广东和江西[23，32-33]。艾氏管鼻蝠是Furey等[34]在越南北干省发现并命名的新种，其特征与金管鼻蝠极为相似，容易混淆。随后的资源调查提示其分布较广，在老挝、越南及中国的广西、贵州、湖南、广东、海南和云南均有分布[2-8，35-38]。本研究报道的上述3种管鼻蝠外部形态和头骨形态指标都与前人的研究基本吻合(表1和表2)。

根据上颌骨牙齿的相对大小和形状可将管鼻蝠类群分成suilla-type和cyclotis-type 2类：suilla-type种类上犬齿齿冠面积小于第2上前臼齿齿冠面积，反之则属于cyclotis-type[25]。云南分布的金管鼻蝠、白腹管鼻蝠、罗蕾莱管鼻蝠、菲氏管鼻蝠和艾氏管鼻蝠5种属于suilla-type，圆耳管鼻蝠和哈氏管鼻蝠属于cyclotis-type。在suilla-type组中，金管鼻蝠、艾氏管鼻蝠和菲氏管鼻蝠的形态相似，体型较小，而白腹管鼻蝠和罗蕾莱管鼻蝠的体型较大，可进一步予以区分。金管鼻蝠和艾氏管鼻蝠的背部颜色相近，整体呈棕色，背部毛尖为黄棕色，艾氏管鼻蝠上犬齿高于P4，且上臼齿(M1和M2)的中附尖发达明显，金管鼻蝠上犬齿和P4几乎等高，上臼齿(M1和M2)的中附尖不明显；菲氏管鼻蝠背部颜色较为深暗，为灰黑色，同时其外形指标及头骨指标都大于艾氏管鼻蝠。体型较大的白腹管鼻蝠和罗蕾莱管鼻蝠2种背部均呈红棕色，白腹管鼻蝠无矢状嵴，P2的高度约为P4的2/3，罗蕾莱管鼻蝠具矢状嵴和人字嵴，P2的高度小于P4的1/2[27]。在cyclotis-type组中，哈氏管鼻蝠体型明显较圆耳管鼻蝠大，且具有发达的矢状嵴和人字嵴，P2和P4基本等高，圆耳管鼻蝠的矢状嵴和人字嵴不发达，P2约为P4的2/3高[1，39]。基于上述形态学特征可将现阶段云南发现的各种管鼻蝠予以鉴别分辨。

根据本次研究采用线粒体COⅠ基因和核基因Rag2构建的系统发育树结果(图3)，也支持由形态特征进行鉴定的分类结果。在本次构建的发育树中也显示出如Kuo等[40]所描述的艾氏管鼻蝠和姬管鼻蝠(M.gracilis)、隐姬管鼻蝠(M.recondita)之间较近的亲缘关系，以及Ruedi等[41]所描述东南亚地区的菲氏管鼻蝠和M.jaintiana存在密切的亲缘关系。线粒体基因COⅠ和核基因Rag2的系统发育树中，菲氏管鼻蝠均存在2个遗传差异比较大的支系，值得后续进一步开展亲缘地理学分析。

云南位于我国西南边陲，终年温暖潮湿，属典型的热带或亚热带季风气候，覆盖有大面积的热带林或亚热带季风林，植被类型多样，生物资源丰富。该区域与越南、老挝和缅甸三国接壤，气候环境及森林植被相似。近年随着对森林型蝙蝠多样性资源调查增多，调查工具不断更新，包括分子系统发育学技术的进步，因此短时间内在云南勐腊集中发现了4种管鼻蝠新记录，揭示了云南翼手目物种资源具有丰富的多样性。周边国家分布的M.jaintiana、M.annamitia、M.fionae等管鼻蝠也可能在云南被发现[1]，提示有进一步加大调查力度的必要。