γ-干扰素释放试验联合环介导等温扩增技术检测在老年肺结核筛选中价值研究

余美玲， 张雅惠， 黄 鹤

广东省结核病控制中心 检验科，广东 广州 510062

肺结核病发病和死亡数长期居于我国甲类、乙类法定报告传染病的前列[1-3]。随着我国社会老龄化程度加剧，老年结核病发病率呈上升趋势。老年人群为结核病患者的重点人群，但该人群对结核病的认知有局限，且老年结核病患者临床症状较为隐匿，常造成漏诊、误诊，延误最佳治疗时间[4-6]。因此，在老年人群中积极推进主动筛查，可弥补传统被动发现方式的不足，提高肺结核的检出率。当机体感染结核分枝杆菌后，可产生特异性记忆T细胞，再次接触结核分枝杆菌时可产生、分泌γ-干扰素，故可通过γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay,IGRA)来判断是否感染结核分枝杆菌。环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下对核酸进行扩增，判断靶基因是否存在[7-9]。两种检测方法均具有较好的诊断价值，但单独检测尚难满足临床需求，且存在争议[10]。本研究对358例疑似肺结核的老年患者分别进行IGRA检测、LAMP检测，探讨两种检测方法联合应用在筛查老年肺结核的价值。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2018年8月至2020年2月胸X线影像异常或临床症状疑似肺结核的358例患者为研究对象。纳入标准：年龄>60岁；具有疑似肺结核症状；有较好沟通能力。排除标准：妊娠期、哺乳期女性；胸部有外伤史或手术史；存在精神障碍者；脏器存在严重合并症者。本组患者男性212例，女性146例；年龄60～83岁。本研究经医学伦理委员会批准，患者了解本研究基本过程，愿意配合研究，并签署知情同意书。

1.2 研究方法 患者均行胸X线影像检查、痰液抗酸染色、痰液结核菌培养检测、IGRA、LAMP，以临床结果作为金标准，分析IGRA联合LAMP检测在老年肺结核筛选中的价值。IGRA检测：采集患者5 ml全血入真空抗凝管，分装到本底对照管(N)、阳性对照管(P)和测试培养管(T)，每个管中均装有刺激抗原，每管1 ml血液，采用酶联免疫吸附法进行检测，试剂盒采用德国凯杰QuantiFERON®-TB(QFT)，操作严格按照说明书进行。将培养管颠倒混匀后，立即放入37℃培养箱培养22 h，培养过程中培养管保持直立；培养后以4 000 r/min 离心10 min，将血浆取出进行检测，根据光密度(optical density，OD)值计算检测结果。LAMP检测：收集即时痰、夜间痰和次晨痰3个痰标本，传统检测方法先进行3个痰涂片检查，根据痰的性状和涂片结果阳性级别选取2份痰标本，采用4%氢氧化钠处理直接接种酸性罗氏培养基方法进行痰培养检查，再选取其中一份进行恒温扩增检测。将反应管至于恒温荧光核酸扩增仪器中的荧光检测模块，打开荧光开关进行检测。观察样品，若有荧光，则判定为阳性。操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以例(百分率)表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床诊断及IGRA、LAMP检测结果 358例疑似肺结核患者的临床诊断结果显示，163例患者为肺结核，195例患者排除肺结核。IGRA检测结果显示，121例患者为肺结核，237例患者排除肺结核。LAMP检测结果显示，68例患者为肺结核，290例患者排除肺结核。见表1。

表1 临床诊断及IGRA、LAMP检测结果/例

2.2 IGRA、LAMP诊断价值 IGRA诊断敏感度为84.30%、特异性为74.26%、准确度为96.31%、阳性预测值为62.58%、阴性预测值为90.25%；LAMP诊断敏感度为91.18%、特异性为65.17%、准确度为95.54%、阳性预测值为38.04%、阴性预测值为96.92%；IGRA联合LAMP诊断敏感度为96.28%、特异性为83.25%、准确度为98.16%、阳性预测值为70.56%、阴性预测值为98.23%。IGRA联合LAMP诊断的特异性、阳性预测值均高于IGRA诊断、LAMP诊断，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 IGRA、LAMP诊断价值/%

3 讨论

有研究报道，在老年人群中开展肺结核病的主动筛查，将极大地提高患者检出率，但要检测这种缓慢生长的病原体，为临床提供快速准确病原学检测结果仍非常困难[3]。分子生物学及免疫学检测技术具有独特的优势。IGRA已被世界卫生组织宣布可作为肺结核潜伏感染的诊断试验，在肺结核诊断中灵敏度较高，特别是对于痰阴性肺结核患者，具有更高的诊断价值[11-12]。LAMP是以核酸扩增为基础的实验技术,克服聚合酶链反应技术需要热循环设备价格高以及对操作人员技术要求高等缺点，同时，该技术采用4个结核分枝杆菌特异性引物以识别目标DNA上的6个不同的特异性区域，以缩短反应时间并提高反应的特异度及灵敏度[13]。LAMP检测过程中不需要热循环仪器进行DNA扩增，具有快速、特异、灵敏和稳定等优点，适合现场和基层进行快速检测[14]。但目前关于IGRA、LAMP在基层肺结核筛查中应用的研究报道较少。

本研究对358例疑似肺结核的老年患者分别进行IGRA、LAMP检测，并以临床诊断作为金标准。本研究结果显示，358例疑似肺结核患者的临床诊断结果显示，163例患者为肺结核，195例患者排除肺结核。IGRA诊断敏感度为84.30%、特异性为74.26%、准确度为96.31%、阳性预测值为62.58%、阴性预测值为90.25%；LAMP诊断敏感度为91.18%、特异性为65.17%、准确度为95.54%、阳性预测值为38.04%、阴性预测值为96.92%；IGRA联合LAMP诊断敏感度为96.28%、特异性为83.25%、准确度为98.16%、阳性预测值为70.56%、阴性预测值为98.23%。IGRA联合LAMP诊断的特异性、阳性预测值均高于IGRA诊断、LAMP诊断，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明，IGRA、LAMP单一诊断的敏感度、准确度和阴性预测值均较高，但是特异性、阳性预测值较低。二者联合检测诊断的价值明显提升，分析其原因可能是因为IGRA采用患者血液样本进行检测，有助于痰液阴性患者的检测；而LAMP采用患者痰液样本进行检测，以核酸扩增为基础，即通过特异性引物结合结核分枝杆菌的促旋酶B亚基基因,在恒温条件下进行扩增。此外，两种检测方法所用的血液样本、痰液样本均较易检测，适合肺结核病的筛查。LAMP检测是针对MTB的DNA为靶序列设计引物并进行扩增，对死菌也表现为阳性。因此，LAMP检测不能对临床抗结核治疗效果进行监测，且实验过程中DNA链结构稳定，不易降解，较高的成本可能会制约临床应用。

综上所述，相较于单一检测诊断，IGRA联合LAMP诊断的特异性、阳性预测值更高，有助于老年肺结核筛选。目前，每种检测肺结核的方法都存在一定弊端，仍需不断研究相关检测方法并加以改善，为肺结核的预防、治疗评估等提供更可靠的方法。