循环外泌体微小RNA-10b表达及去甲基化状态在诊断结直肠癌肝转移及预测早期转化治疗反应中临床价值

陈思敏， 唐诗宇， 张智彬， 王秋晓， 关丽娜， 唐学贵

川北医学院肛肠疾病研究所，四川 南充 637000

消化道和盆腔肿瘤易发生肝转移，这是肿瘤恶性发展的关键步骤，也是导致原发性肿瘤治疗失败的主要原因之一[1]。多数结直肠癌早期诊断率较低，常在发生肝转移后才出现临床症状，导致患者预后不良。因此，早期肝转移的诊断和治疗对原发性肿瘤的控制具有重要意义。转移前生态位的形成为肿瘤细胞的血行扩散提供支持性的微环境，肝窦内皮细胞在肿瘤细胞肝转移过程中发挥着关键作用[2]。微小RNA-10b(microRNA-10b，miR-10b)在许多恶性肿瘤中表达上调，促进适宜肿瘤细胞远处定植的转移前生态位的形成，从而介导肿瘤细胞发生肝组织特异性定植和转移[3]。癌源性外泌体在肝转移过程中发挥信号传导的作用，为验证miR-10b与结直肠癌患者肝转移的关系，笔者收集154例结直肠癌患者的血液样本，提取循环血外泌体并检测外泌体miR-10b的表达情况及去甲基化状态，评估其作为肝转移诊断和监测早期转化治疗反应性的生物标志物的可能性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年1—12月收治的结直肠癌同时性肝转移患者75例为肝转移组，其中，男性52例，女性23例；年龄范围39～76岁，年龄(57.28±10.64)岁。选取同时期在我院确诊为结直肠癌且未合并任何脏器转移患者75例为未转移组(局灶性结直肠癌患者，临床病理分期Ⅰ～Ⅲ期)，其中，男性48例，女性27例；年龄范围32～78岁，年龄(56.31±12.43)岁。两组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：患者经病理学诊断，确诊为原发性结肠癌或直肠癌患者；经CT引导下穿刺病理和(或)超声、CT或 MRI资料随访证实，肝转移组为同时性肝转移癌患者，且具有可测量的肝转移灶，未转移组为未合并任保脏器转移患者；血液样本采集时均未接受过放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗或手术；肝转移灶被评估为初始不可切除且接受转化治疗者，包括西妥昔单抗-FOLFOX4或西妥昔单抗-FOLFIRI一线化疗方案。排除标准：原发性肝细胞癌、肝硬化患者或合并其他部位恶性肿瘤患者；合并其他器官转移者；预计生存时间<3个月者。

1.3 研究方法

1.3.1 血清样本获取及处理 两组患者在入院时采集外周血样4 ml，收集血清样本后立即通过离心法提取外泌体，并在-80℃下储存在无RNase的Eppendorf管中直到使用。此外，取无外泌体血清标本设为阴性对照组。

1.3.2 提取外泌体 待血清样本冷冻两个月后，4℃下复溶，3 000 r/min离心15 min，丢弃细胞碎片。使用ExoQuick Exosome沉淀试剂(美国System Biosciences公司)从血清样本中分离出外泌体。用透射电子显微镜(美国FEI公司)观察外泌体形态。进行纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，得到所有样品中的外泌体粒径。用免疫印迹法检测外泌体标志蛋白Alix、热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70、HSP90、Tsg101蛋白表达情况。一抗购自美国System Biosciences公司。

1.3.3 提取外泌体总RNA 采用miRCURYTMRNA提取试剂盒(丹麦Exiqon公司)提取外泌体总RNA，用200 μl去离子水重悬外泌体，加入60 μl裂解液，室温下孵育3 min。12 000 r/min离心3 min。加入异丙醇，将样品装载到分离柱上，用去离子水洗脱3次。通过Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent公司)和RNA 6000 Pico试剂盒(美国Agilent公司)对分离的RNA质量进行测定。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链式反应法测定外泌体miR-10b表达 使用qScript microRNA cDNA合成试剂盒(美国Quanta Bio Sciences公司)将150 ng总RNA反转录为cDNA。首先，加入poly A加尾反应试剂，37℃ 60 min，70℃ 5 min。对于第一链cDNA合成反应，培养条件为42℃下20 min，85℃下5 min。使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix(美国Quanta BioSciences公司)在以下条件下进行实时荧光定量聚合酶链式反应：1次循环，95℃ 2 min；40次循环，95℃ 5 s，60℃ 15 s，70℃ 15 s。所有反应均以一式三份的方式进行。miR-10b的表达水平使用小分子U6作为内源性参考基因进行标准化。每个miRNA的相对表达用2-ΔΔCt方法计算。miRNA引物购自美国Quanta BioSciences公司。所有实验引物均由Primer Blast 网站设计。miR-10b的正义链引物序列为5′-CCA GAG GTT GTA ACG TTG TCT-3′，反义链引物序列为5′-TGC ATC GAC CAT ATA TTC CCC T-3′，产物大小101 bp。小分子U6的正义链引物序列为5′-GCA GAC CGT TCG TCA ACC TA-3′，反义链引物序列为5′-AAT TCT GTT TGC GGT GCG TC-3′，产物大小149 bp。

1.3.5 miR-10b基因启动子甲基化检测 利用EZ DNA甲基化金试剂盒(美国Zymo公司)用亚硫酸氢钠转化500 ng基因组DNA样本。使用正向和反向生物素化引物(美国Sigma公司)扩增感兴趣区域。选择代表miR-10b的探针，与相应的miRNA表达呈最高的负相关。miR-10b甲基化引物序列：正义链引物序列为5′-GTA TTG TAT AGT GTT GAG GTG TTG G-3′，反义链引物序列为5′-ATC CAA ACT AAC CTC TCC ATT CCA C-3′。miR-10b非甲基化引物序列：正义链引物序列为5′-TAA GTA TTG TAT AGT GTC GAG GCG T-3′，反义链引物序列为5′-ATC CGA ACT AAC CTC TCC GTT CCG C-3′。按照试剂盒说明书(美国Zymo Research公司)采用PyroMark Q24系统(德国Qiagen公司)进行焦测序，包括甲基化和非甲基化DNA对照。

1.4 治疗方法 根据国家癌症综合网络[4]制定的指南，所有肝转移患者接受西妥昔单抗-FOLFOX4或西妥昔单抗-FOLFIRI。FOLFOX4方案为：奥沙利铂静脉输注85 mg/m2，静脉输注四氢叶酸盐400 mg/m2，静脉输注5-氟尿嘧啶400 mg/m2；连续泵送5-氟尿嘧啶3 000 mg/m2超过46 h。FOLFIRI方案为：静脉输注伊立替康180 mg/m2，静脉输注四氢叶酸盐200 mg/m2，静脉输注5-氟尿嘧啶400 mg/m2；连续泵送5-氟尿嘧啶3 000 mg/m2超过46 h。每个疗程14 d。每天静脉输注西妥昔单抗500 mg/m2，每个疗程14 d。共完成4个疗程。所有患者均在化疗前1周内和化疗结束后2～3周内进行CT/MRI检查。

1.5 疗效评价 主要研究终点是达到客观缓解的患者比例[5]。完全缓解指所有靶病变消失；部分缓解指基线病变的最大直径总和减少至少30%；疾病进展指基线病变的最大直径之和至少增加20%或出现新的病变。对于化疗后未达到客观缓解，也未观察到疾病进展证据者，视为稳定的疾病状态。

2 结果

2.1 外泌体的形态特征、NTA分析及标志蛋白表达 通过透射电镜观察外泌体，结直肠癌患者血清外显体多呈圆形、双层膜囊泡状结构；根据NTA分析，所描述的粒径分布呈钟形曲线，表明在90 nm处有1个峰值。经免疫印迹法分析证实，与阴性对照组比较，未转移组与肝转移组血清外泌体相关标记物Alix、HSP70、HSP90、TSG101均高表达，说明提取的囊泡具有外泌体的典型特征，可用于后续研究。见图1～2。

图1 从结直肠癌患者血清中分离的外泌体特征(a.透射电镜图像显示外体的特征结构，直径约为90 nm；b.NTA测量的血清外显体的大小分布，在90 nm处有1个峰值) 图2 血清外泌体标记物Alix、HSP70、HSP90和TSG101表达水平

2.2 两组患者血清外泌体中miR-10b相对表达量 肝转移组患者血清外泌体miR-10b为(1.34±0.35)，显著高于未转移组的(1.00±0.17)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 两组患者血清外泌体miR-10b相对表达量

2.3 血清外泌体miR-10b对结直肠癌肝转移的诊断价值 用ROC曲线对血清外泌体miR-10b用于肝转移诊断的效能进行评价。ROC曲线下面积(area under curve，AUC)为0.787(95%可信区间0.713～0.860，P<0.001)。血清外泌体miR-10b诊断肝转移的敏感度及特异度分别为91.50%、65.50%。见图4。

图4 血清外泌体miR-10b诊断肝转移的ROC曲线

2.4 两组患者血清外泌体miR-10b启动子甲基化状态差异 肝转移组患者血清外泌体miR-10b基因启动子甲基化率为30.7%(23/75)，低于未转移组的74.7%(56/75)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。肝转移组患者中，甲基化患者血清外泌体miR-10b相对表达量为(1.04±0.16)，显著低于未甲基化患者的(1.47±0.32)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图5 两组患者血清外泌体miR-10b甲基化状态

图6 肝转移组miR-10b甲基化与未甲基化患者miR-10b表达情况

2.5 肝转移组患者一线化疗反应情况 所有患者均完成4个疗程的化疗方案，无患者完全缓解，34例患者部分缓解，24例患者出现疾病进展，17例患者疾病稳定。将肝转移患者分为治疗有效组(部分缓解，34例)与无效组(疾病稳定、疾病进展，41例)。治疗有效组患者血清外泌体miR-10b相对表达量为(1.06±0.16)，低于无效组的(1.57±0.28)；治疗有效组甲基化率为52.9%(18/34),高于无效组的12.2%(5/41)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.6 肝转移患者一线化疗反应率影响因素分析 经多因素Logistic回归分析，多发转移灶、肝叶侵犯、血清外泌体miR-10b甲基化是影响肝转移患者一线化疗反应率的独立因素(P<0.05)。见表1。

表1 肝转移患者一线化疗反应率影响因素分析

2.7 血清外泌体miR-10b相对表达量对肝转移患者一线化疗获得客观缓解的早期预测价值 用ROC曲线对血清外泌体miR-10b用于肝转移患者一线化疗反应率的预测效能进行评价， AUC为0.950(95%可信区间0.902～0.999，P<0.001)。血清外泌体miR-10b预测肝转移患者一线化疗后获得客观缓解的敏感度及特异度分别为93.50%、87.50%。见图7。

图7 血清外泌体miR-10b相对表达量预测肝转移患者一线化疗反应率的ROC曲线

3 讨论

本研究旨在探讨外泌体miR-10b相对表达量和甲基化状态与结直肠癌患者肝转移的关系，以评价其作为肝转移诊断生物标志物以及用于预测一线化疗反应性的临床效能，从而有助于了解miR-10b在结直肠癌患者发生肝转移中的作用及为肝转移的早期诊断提供新的线索和依据。本研究显示，与未转移组患者比较，肝转移组患者血清外泌体miR-10b相对表达量升高，同时，基因启动子甲基化率降低。此外，本研究纳入的肝转移患者均选择西妥昔单抗-FOLFOX4或西妥昔单抗-FOLFIRI作为一线化疗方案，完成4个疗程化疗后，治疗有效组(获得完全缓解或部分缓解)患者的治疗前血清外泌体miR-10b相对表达量低于无效组，基因启动子甲基化率较高；且经多因素Logistic回归分析，血清外泌体miR-10b基因启动子甲基化是影响肝转移患者一线化疗反应率的独立预测因素。

肿瘤转移是肿瘤恶性发展的关键步骤，也是导致原发性肿瘤治疗失败的主要原因之一。多数癌细胞，特别是消化道肿瘤、盆腔肿瘤等，会优先定植和转移至肝。肝转移癌的发生率远远高于原发性肝细胞癌[6]。许多恶性肿瘤早期诊断率较低，常在肝转移后出现临床症状，导致治愈率低。因此，早期肝转移的诊断和治疗对原发性肿瘤的控制具有重要的临床意义。肝转移的进展包括转移前生态位的形成和肿瘤的侵袭。转移前生态位的形成为肿瘤细胞的扩散提供一个支持性的微环境，包括炎症、免疫抑制、血管生成、血管通透性、淋巴管生成和器官向性等[7]。转移前生态位形成的一系列事件为肿瘤细胞的血行转移和定植准备适宜的微环境，并支持这些转移细胞的植入和存活。原发性肿瘤释放的循环因子对于激发肿瘤细胞的转移潜能以及特异性靶器官定向转移具有重要作用[8]。在这一阶段，内皮屏障被血管内皮生长因子、活性氧、炎症因子或花生四烯酸代谢产物的诱导所破坏[9]。然而，这一阶段很难在临床上评估。

血清外泌体因包含丰富的特异性蛋白、编码RNA、小分子非编码RNA等，参与肿瘤细胞肝转移过程。miR-10b在多种类型恶性肿瘤转移过程中扮演着重要角色。缺氧诱导因子-1ɑ能够上调miR-10b表达，进而促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖和转移过程[10]。启动子低甲基化引起的miR-10b-3p表达上调有助于食管鳞状细胞癌的进展，包括细胞增殖、克隆形成、侵袭、转移等。通过建立异种移植瘤模型研究结果显示，miR-10b-3p表达量上调可促使模型裸小鼠发生肝转移，其下游靶点包括FOXO3蛋白，因此注射外源性miR-10b-3p拮抗剂可降低裸小鼠肿瘤生长速度和肝转移风险[11]。有研究表明，miR-10b在转移性结肠癌细胞系中表达上调，抑制miR-10b通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来阻止癌细胞的转移和生长[12]。KLF4是miR-10b的直接靶点，miR-10b抑制剂导致E-钙粘蛋白表达上调和细胞周期蛋白D1下调，沉默KLF4后细胞周期蛋白D1表达被部分抑制[13]。本研究证实，肝转移组患者血清外泌体miR-10b相对表达量低于未转移组患者，且基因启动子甲基化率降低，两者具有负一致性，说明肝转移患者血清外泌体miR-10b表达量下降与基因发生去甲基化有关。且有研究证实，血清外泌体比原发性肿瘤细胞更早到达肝，在肿瘤细胞与其微环境之间传递信息，在转移前生态位形成中具有重要作用[14]。血清外泌体具有3个主要特点：高灵敏度，外泌体能实时反映原发细胞的状态；稳定性，外泌体能抵抗循环的核糖核酸酶和蛋白酶的降解；高浓缩，外泌体可以被释放到生物液中，为识别肿瘤患者提供一种无创的方法[15]。本研究通过ROC曲线分析证实，血清外泌体miR-10b可用于结直肠癌肝转移的临床诊断。

血清外泌体miR-10b除具有诊断肝转移的潜力以外，还与肝转移患者一线化疗反应有一定的关系。治疗有效组患者血清外泌体miR-10b表达明显低于无效组，说明miR-10b与化疗药物反应性和耐药性也有一定的关联，miR-10b有望成为预测结直肠癌肝转移者化疗敏感性的潜在指标，但其在预测患者长期预后方面的价值仍有待确定。经多因素Logistic回归分析证实，血清外泌体miR-10b基因启动子甲基化是肝转移患者化疗敏感的独立影响因素，结合基因甲基化状态是影响miR-10b表达量下调的重要原因，故笔者认为血清外泌体miR-10b相对表达量结直肠癌肝转移患者一线化疗的疗效有较高的预测价值。

综上所述，结直肠癌肝转移患者血清外泌体miR-10b相对表达量上调，且其在肝转移的诊断方面具有一定潜力。此外，外泌体也是治疗肝转移的理想候选物，外泌体miR-10b基因启动子甲基化是影响肝转移患者转化治疗反应性的独立影响因素，检测血清外泌体miR-10b相对表达量有望为早期预测肝转移患者的化疗敏感性提供一定的参考价值，有助于临床制定个体化治疗方案。