虎杖苷通过沉默信息调节因子2相关酶3上调PINK1-Parkin线粒体自噬减轻脓毒症小鼠急性肺损伤机制研究

李 涛， 王 香

郴州市第一人民医院 重症医学科， 湖南 郴州 423000

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指各种肺内或肺外因素引起的以低氧血症为特点的临床综合征。虽然保护性肺通气等生命支持治疗取得一定进步，ALI的治疗效果也较为明确，但由于其发病机制不清，临床仍缺乏特效的治疗措施或药物，其病死率仍居高不下[1]。因此，阐述ALI的发病机制、积极寻找相关的治疗靶点及药物具有重要临床意义。线粒体自噬是一种选择性细胞自噬，细胞通过该机制选择性清除多余或异常的线粒体，以维护细胞内线粒体质量及功能的稳态[2]。在PINK1-Parkin途径线粒体自噬中， PINK1募集细胞质中的Parkin向线粒体移位，而Parkin通过泛素化多种蛋白底物，进而将该线粒体包裹并形成自噬体，最终被溶酶体清除[3]。虎杖苷通过促进Parkin依赖的线粒体自噬减轻脓毒症急性肺损伤小鼠细胞凋亡，但机制尚未阐述清楚[4]。有研究表明，虎杖苷通过激活沉默信息调节因子2相关酶3(silent information regulator factor 2 related enzyme 3,SIRT3)减轻脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介导的肺泡上皮细胞损伤[5]。同时，SIRT3参与PINK1-Parkin线粒体自噬的调节[6]。本研究旨在探讨虎杖苷是否通过SIRT3促进PINK1-Parkin线粒体自噬，进而减轻脓毒症小鼠急性肺损伤。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 线粒体分离试剂盒、免疫共沉淀试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。兔抗小鼠SIRT3、磷酸甘油醛脱氢酶、COX Ⅳ、PINK1、Parkin、叉头框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3)单克隆抗体，以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒购于武汉ABclonal公司。SIRT3去乙酰化酶活性检测试剂盒购于英国Abcam公司。抗赖氨酸乙酰化抗体购于杭州景杰生物科技有限公司。

1.2 实验动物与分组 SPF级野生型C57BL/6小鼠24只，体质量22～25 g，购于南方医科大学实验动物中心。小鼠随机分为4组，每组6只。对照组：野生型小鼠建立假ALI模型，即气管内滴注等体积生理盐水。模型组：野生型小鼠建立ALI模型处理，小鼠麻醉后钝性分离气管，向气管内缓慢滴注5 mg/kg LPS，并轻拍肺部使LPS均匀分布肺内，缝合。治疗组：野生型小鼠建立ALI模型后立即予以45 mg/kg虎杖苷处理[7]。抑制组：野生型小鼠建立ALI模型后立即予以45 mg/kg虎杖苷及5 mg/kg 3-TYP处理[8]；小鼠在操作12 h后处死并检测相关指标。

1.3 研究方法

1.3.1 蛋白免疫印迹实验 肺组织匀浆、离心提取总蛋白或通过线粒体分离试剂盒分离线粒体蛋白及细胞质蛋白。浓缩胶为5%，分离胶为12%，电泳后转移到FVDF膜，一抗[SIRT3(1∶1 000)、 PINK1(1∶1 000)、Parkin(1∶1 000)、COX Ⅳ(1∶2 000)、磷酸甘油醛脱氢酶(1∶5 000)]4℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，免疫化学发光法曝光并进行灰度值分析。

1.3.2 FOXO3乙酰化检测 通过免疫共沉淀法检测FOXO3乙酰化水平，参照试剂盒说明书，肺组织充分裂解，取500 μl组织裂解液，加入10 μl FOXO3抗体，4℃缓慢摇动过夜；再加入40 μl protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动2 h；再1 000 g离心5 min，吸除上清，PBS洗涤5次，加入等体积2×SDS-PAGE电泳缓冲液重悬，100℃煮沸5 min，此为纯化的FOXO3样本；收集好的FOXO3样本通过蛋白免疫印迹实验检测赖氨酸乙酰化水平，方法同上。

1.3.3 SIRT3去乙酰化酶活性测定 肺组织匀浆后反应于500 μl的免疫沉淀缓冲液中，SIRT3蛋白被提取出来。根据试剂盒说明建立反应体系(5 μl样本+25 μl ddH2O+5 μl assay buffer+5 μl荧光底物+5 μl显色剂+5 μl NAD，反应总体积为50 μl)，酶标仪下进行荧光定量(激发光340 nm，发射光460 nm)。

1.3.4 肺组织病理检测 处死后取肺组织10%中性福尔马林固定、切片、脱蜡至水后HE染色，400倍光镜下观察肺病理改变。

1.3.5 肺水肿 采用肺组织湿干重比(Wet/Dry,W/D)反映肺水肿，分离肺组织并用吸水纸吸干表面水分后称量肺湿重，置于80℃烤箱72 h，称量肺干重，肺W/D=肺湿重/肺干重。

1.3.6 血清炎症因子检测 全血室温静置30 min后离心，取上清，参照说明书方法，采用酶联免疫吸附测定法检测TNF-ɑ、IL-1、IL-6炎症因子水平。

2 结果

2.1 虎杖苷对SIRT3表达及活性的影响 与对照组比较，模型组SIRT3表达及活性均显著下降；与模型组比较，治疗组SIRT3表达及活性均显著增加；与治疗组比较，抑制组SIRT3表达无明显下降，但SIRT3活性显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

图1 虎杖苷对SIRT3表达的影响

表1 虎杖苷对SIRT3表达及活性的影响

2.2 虎杖苷通过SIRT3促进PINK1-Parkin线粒体自噬 与对照组比较，模型组PINK1及线粒体Parkin表达显著增加，细胞质Parkin显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示PINK1-Parkin线粒体激活。与模型组比较，治疗组PINK1及线粒体Parkin表达增加，细胞质Parkin下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示虎杖苷促进PINK1-Parkin线粒体自噬。与治疗组比较，抑制组PINK1及线粒体Parkin表达显著下降，细胞质Parkin显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示抑制SIRT3显著抑制虎杖苷诱导的线粒体自噬。见图2，表2。

图2 虎杖苷对PINK1-Parkin线粒体自噬相关蛋白表达的影响

表2 虎杖苷对PINK1-Parkin线粒体自噬相关蛋白表达的影响

2.3 虎杖苷通过SIRT3介导FOXO3去乙酰化 模型组FOXO3乙酰化水平[(332.0%±21.1%)]显著高于对照组[(100.0%±6.8%)]；治疗组FOXO3乙酰化水平[(216.0%±17.6%)]显著低于模型组，抑制组FOXO3乙酰化水平[(297.0%±30.9%)]显著高于治疗组，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示虎杖苷介导FOXO3去乙酰化，抑制SIRT3可以显著抑制虎杖苷介导的FOXO3去乙酰化。见图3。

图3 虎杖苷对FOXO3乙酰化水平的影响

2.4 虎杖苷对肺损伤的影响 模型组小鼠肺组织可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺出血等；与模型组比较，治疗组小鼠肺组织炎性细胞浸润、肺出血等减轻，肺泡壁变薄；与治疗组比较，抑制组小鼠肺组织炎性细胞浸润、肺出血等增加，肺泡壁增厚。见图4。模型组血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及肺W/D显著高于对照组；与模型组比较，治疗组小鼠血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及肺W/D显著低于模型组；抑制组小鼠血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及模型组显著高于治疗组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图4 肺组织病理检测(HE染色×400;a.对照组；b.模型组；c.治疗组；d.抑制组)

表3 虎杖苷对肺损伤及血清炎症因子的影响

3 讨论

在PINK1-Parkin途径线粒体自噬中，主要分为两步[3]：(1)PINK1在线粒体稳定表达并募集Parkin向线粒体的移位；(2)线粒体聚集体形成及线粒体最终被自噬降解。正常情况下，线粒体PINK1表达非常低，因为线粒体内膜的骨骼肌细胞线粒体膜蛋白(presenilin associated rhomboid-like protease，PARL)可以降解线粒体中的PINK1，当线粒体异常导致其膜电位下降后，PARL活性被抑制，PINK1可以稳定在线粒体上，进而通过磷酸化作用募集Parkin向线粒体移位。Parkin是一种E3泛素连接酶，能催化VDAC1、Mfn等泛素化，进而介导p62等自噬调节蛋白被募集到线粒体并形成线粒体聚集体，进而被自噬体吞食、降解。

有研究表明，PINK1-Parkin线粒体自噬通过自我清除异常或多余的线粒体维护细胞内线粒体质量及稳态，在肿瘤、心血管、神经系统、代谢性等疾病中发挥促进细胞存活的作用[9-10]。而关于PINK1-Parkin线粒体自噬在脓毒性ALI中的研究尚不多见。在本研究中，笔者通过检测PINK1表达及Parkin向线粒体移位，证实虎杖苷可以显著促进脓毒症ALI中PINK1-Parkin线粒体自噬。本研究再次验证笔者既往的研究成果[4]。

SIRT3是线粒体主要的去乙酰化酶，通过调节线粒体代谢关键酶的乙酰化水平，参与代谢、三磷酸腺苷生成、调节氧化应激反应等[11]。有研究表明，SIRT3通过调控PINK1-Parkin介导的线粒体自噬促进糖尿病性角膜上皮愈合[12]；SIRT3通过P53及PGC-1α调节线粒体自噬并减轻高糖介导的心肌细胞损伤[13]。既往研究发现，虎杖苷通过激活SIRT3减轻LPS介导的肺泡上皮细胞线粒体损伤及氧化应激[5,14]。本研究结果证实，抑制SIRT3可以显著抑制虎杖苷诱导的PINK1-Parkin线粒体自噬。有研究表明，虎杖苷通过Parkin依赖的线粒体自噬减轻ALI中线粒体损伤及细胞凋亡[4]。为进一步验证虎杖苷是否通过SIRT3调节线粒体自噬，笔者证实抑制SIRT3可以显著减轻虎杖苷在ALI中的保护作用，其表现为虎杖苷减轻肺损伤及炎症反应的作用被抑制。因此，笔者推测，虎杖苷通过激活SIRT3上调PINK1-Parkin线粒体自噬，进而减轻ALI。

FOXO3是属于叉头框蛋白家族的O亚型，参与调节细胞凋亡、代谢、增殖、存活等，具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化应激等作用，其关键位点的磷酸化、去磷酸化、乙酰化、去乙酰化等翻译后修饰决定其活性及亚细胞定位[15]。有研究发现，SIRT3通过去乙酰化FOXO3介导PINK1-Parkin线粒体自噬抵抗氧化应激[6]。FOXO3的去乙酰化促进其进入细胞核，进而促进PINK1的转录可能是其调节PINK1-Parkin线粒体自噬的机制[16]。在本研究中，笔者证实虎杖苷可以通过SIRT3显著促进FOXO3去乙酰化。

综上所述，虎杖苷通过SIRT3去乙酰化FOXO3，进而促进PINK1-Parkin线粒体自噬，减轻ALI小鼠氧化应激及炎症反应。