胞外聚合物在腐败希瓦氏菌处理铀污染地下水中的作用

黄凤羽，张海玲，王永鹏，王 哲,*，易发成，曾 铮

(1.西南科技大学 环境与资源学院，四川 绵阳 621010；2.中国工程物理研究院 材料研究所，四川 江油 621700)

铀矿开采和矿山尾矿会对邻近地下水造成铀污染，其铀含量高达50 mg/L[1]。由于铀的重金属毒性和放射性危害，含铀地下水的处理一直以来都受到广泛关注。传统的处理方式主要是物理化学方法(混凝沉淀法[2]、离子交换法[3]、吸附法[4]、膜分离法[5]等)，在去除含铀地下水的同时通常有难以再生或二次污染等缺点[6-7]。微生物原位处理技术有原料充足、成本低、处理效率高、环境友好等优点，越来越受到人们的重视[8-10]。微生物对铀的去除已有广泛的研究，厌氧颗粒污泥[11]、硫酸盐还原菌、希瓦氏菌和假单胞菌等[12-14]都被证明对降低地下水中的铀浓度具有长期有效性。微生物固定铀的4个基本机制为：1) 微生物将U(Ⅵ)还原沉淀为U(Ⅳ)；2) 细胞对U(Ⅵ)的吸收和积累；3) 微生物细胞表面对铀的吸附；4) 细胞释放的无机磷酸盐与U(Ⅵ)配位沉淀[15-17]。

1 实验

1.1 主要试剂与仪器

腐败希瓦氏菌(22940)，中国工业微生物菌种保藏管理中心；DOWEX MARATHON C阳离子交换树脂(CER，20～50目)、乳酸钠(99.0%)，美国Sigma-Aldrich；UO2SO4·3H2O(99.99%)，湖北楚盛威化工有限公司，配制成2 200 mg/L U(Ⅵ)储备液。其他试剂均为市售分析纯，所有溶液均采用Milli-Q水制备。

模拟地下水溶液的配制参照文献[11]，包括矿物元素和微量元素，具体如下：NH4HCO3，5 mg/L；K2HPO4，2 mg/L；MgCl2，2.1 mg/L；Ca(OH)2，1 mg/L；酵母提取物，0.33 mg/L；H3BO3，0.5 μg/L；FeSO4·7H2O，28 μg/L；ZnSO4·7H2O，1.1 μg/L；CuSO4·5H2O，1.6 μg/L；MnSO4·H2O，2.5 μg/L；(NH4)6Mo7O24·4H2O，2.0 μg/L；KAl(SO4)2·12H2O，1.75 μg/L；CoSO4·7H2O，23.6 μg/L；NiSO4·6H2O，1.13 μg/L；Na2SeO3·5H2O，1 μg/L；Na2WO4·2H2O，5.2 μg/L；EDTA，10 μg/L。将模拟地下水溶液压力灭菌20 min，冷却至室温后加入1 g/L NaHCO3溶液，将pH值调至7.0。U(Ⅵ)在地下水中的络合形态主要是碳酸氢盐结合态，因此用NaHCO3溶液作为模拟地下水溶液的缓冲溶液[13]，最后充氮气10 min除去溶解氧。

NEXION 350电感耦合等离子体质谱仪、Nicolet-5700傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，美国Perkin Elmer公司；D3024台式高速微量离心机，美国赛洛捷克。

1.2 腐败希瓦氏菌培养

在无菌条件下将保存的腐败希瓦氏菌液按2%(体积分数)的接种量接到盛有培养基(组成为：胰蛋白胨，15 g；酵母提取物，5 g；氯化钠，5 g；水，1 L)的锥形瓶内，再置于恒温振荡器中(30 ℃，150 r/min)培养18 h，培养好的菌液以8 000 r/min离心5 min，之后用0.1 mol/L NaCl溶液洗涤2次。

1.3 腐败希瓦氏菌对U(Ⅵ)的固定

所有实验均在氮气条件下进行。具体步骤如下：1) 向50 mL血清瓶中加入20 mL模拟地下水溶液，再加入0.27 mL U(Ⅵ)储备溶液，使体系U(Ⅵ)最终浓度为30 mg/L；2) 在上述溶液中依次加入腐败希瓦氏菌和乳酸钠，浓度分别为6×108mL-1和10 mmol/L；3) 充高纯氮驱氧，用丁基橡胶塞和铝密封件密封，温度控制在(30±1) ℃；4) 在厌氧条件下定期用注射器从血清瓶中抽取0.5 mL菌体样液进行分析。反应结束后，取10 mL混合液进行EPS提取分析。每组实验均进行平行实验，并设置不加腐败希瓦氏菌的空白对照组。

1.4 分析方法

反应后腐败希瓦氏菌体中U(Ⅵ)和U(Ⅳ)的含量根据文献[24-25]的方法，采用NaHCO3-HNO3连续萃取法对腐败希瓦氏菌中固定的铀进行提取，其原理如图1所示。在该方法中，NaHCO3萃取的是吸附/络合的U(Ⅵ)，而HNO3萃取的是不溶性U(Ⅳ)沉淀。在厌氧条件下定期用注射器从血清瓶中抽取0.5 mL菌体溶液，8 000 r/min离心分离5 min后，上清液过0.22 μm滤膜，记为U上清。剩余菌体细胞用厌氧0.1 mol/L NaCl溶液洗涤2次，去除菌体表面残留的U(Ⅵ)后，再加入0.5 mL 1 mol/L厌氧NaHCO3溶液提取菌体中的U(Ⅵ)，厌氧条件下放置过夜后离心分离，上清液记为UNaHCO3。最后，再加入0.5 mL 10% HNO3提取菌体中的U(Ⅳ)，放置4 h后离心分离，上清液记为UHNO3。所有样品均在5%HNO3中酸化保存，然后用ICP-MS测各组分浓度。

图1 腐败希瓦氏菌中U的NaHCO3-HNO3萃取法提取原理Fig.1 Extraction principle of U from Shewanella putrefaciens by NaHCO3-HNO3 fractionation method

1.5 EPS提取

采用阳离子交换树脂(CER)法、超声波法和离心法3种方法提取EPS。反应后的腐败希瓦氏菌用0.1 mol/L厌氧NaCl溶液(使用前煮沸并通入氮气驱氧)清洗2次，去除细胞表面的可溶性残留物质，再用0.1 mol/L厌氧NaCl溶液悬浮至10 mL。所有EPS提取过程均在厌氧条件下进行。

CER法：离子交换树脂可除去EPS和细胞之间的二价桥接离子，促使EPS从细胞表面脱附。取4 mL洗涤后的细胞悬浮液，按照70 g/g 的可挥发性悬浮物(VSS)标准称取CER量，600 r/min搅拌提取1 h，以14 510 r/min离心20 min，上清液过0.22 μm滤膜。

超声波法：超声波法提取EPS的原理是利用超声波产生的压力冲击使EPS和细胞分离。取4 mL洗涤后的细胞悬浮液，置于超声清洗器(150 W)中提取10 min，14 510 r/min离心20 min，上清液过0.22 μm滤膜。

离心法：离心法提取EPS的原理主要是利用高速离心产生的重力场作用，使EPS和细胞分离。取2 mL洗涤后的细胞悬浮液，以14 510 r/min的速度离心20 min，上清液过0.22 μm滤膜。

1.6 SP-ICP-MS分析EPS中的U

用单颗粒ICP-MS(SP-ICP-MS)对过0.22 μm滤膜后的EPS提取液中的可溶性U和颗粒U进行定量分析，并对颗粒U的粒径分布进行分析。在单颗粒模式下，可溶性铀酰离子的信号与含铀粒子的信号明显不同。因此，EPS中矿物U的含量为总U浓度与可溶性U浓度的差值。为表征纳米级铀粒子的粒径分布，用已知粒径和颗粒浓度的纳米银(nanoComposix公司)作为标准粒子。单个胶体粒子进入后会在等离子体焰矩内被粒子化为离子簇，以瞬时信号的形式被质谱检测到。其中信号强度反映颗粒粒径，信号频率反映颗粒浓度。

1.7 EPS反应前后FT-IR分析

将反应前后的EPS冷冻干燥后进行FT-IR分析，采用KBr压片法，扫描波数为400～4 000 cm-1，扫描次数为10，分辨率为4 cm-1。

2 结果与分析

2.1 腐败希瓦氏菌对U(Ⅵ)的固定

在腐败希瓦氏菌固定U(Ⅵ)反应过程中，对上清液中U的浓度(U上清)进行测定，并分析实验各阶段菌体中的U含量(U菌体=UNaHCO3+UHNO3)和系统的物质平衡(U系统=U上清+U菌体)，结果示于图2。UNaHCO3和UHNO3分别为吸附的U(Ⅵ)(如U(Ⅵ)离子、U(Ⅵ)-碳酸盐矿物)和还原的U(Ⅳ)的浓度。由图2可知，未加腐败希瓦氏菌的空白组的U含量没有明显变化，说明U在实验体系中没有发生沉淀。上清液中U(Ⅵ)浓度随时间的增加不断下降，在0～28 h内腐败希瓦氏菌对铀的去除速度最快，之后逐渐趋于平稳，最终的去除率为90.9%。由图2还可看出，系统的U含量(U系统)在反应过程中没有明显变化，表明溶液中的U被腐败希瓦氏菌固定，系统有很好的物质平衡。由于碳酸氢盐是地下水系统中广泛存在的无机配体[26]，所以本文着重模拟地下水碳酸氢根的体系。体系的初始pH值设定为7.0，但实验中发现，pH值随反应的进行因腐败希瓦氏菌消耗底物而有所下降，从7.0下降至6.2，处于弱酸性。对于酸度更大的环境(pH<6)，这些材料可能也会适用，后续会进行相关研究。

图2 腐败希瓦氏菌固定U(Ⅵ)过程中U上清、U菌体和U系统随时间的变化Fig.2 Usupernatant, Ucells and Usystem in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

NaHCO3-HNO3连续提取反应过程中腐败希瓦氏菌体的U(Ⅳ)和U(Ⅵ)含量的变化示于图3。由图3可知，UNaHCO3和UHNO3随时间的增加而增加，说明腐败希瓦氏菌至少可通过吸附/络合和还原两种方式固定U(Ⅵ)。菌体中的铀含量由最初的(0.89±0.09) mg/L增加到(20.70±0.71) mg/L，与上清液中U减少的浓度大体一致，表明溶液中的U(Ⅵ)已被腐败希瓦氏菌固定。在初始厌氧条件下(t<8 h时)，UHNO3较低，这是由于腐败希瓦氏菌在反应初期对缺氧体系的适应性调整，还原率较低，而随着反应的进行表现出较好还原效果。UHNO3从最初的(0.11±0.03) mg/L增加到反应结束时的(4.02±0.38) mg/L。以上结果表明，腐败希瓦氏菌除吸附作用外还具有还原U(Ⅵ)的能力，可有效将地下水中的U(Ⅵ)还原为U(Ⅳ)。

图3 腐败希瓦氏菌固定U(Ⅵ)过程中UNaHCO3和UHNO3随时间的变化Fig.3 UNaHCO3 and UHNO3 in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

反应过程菌体中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的变化示于图4。U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比随时间的推移逐渐增加，表明随着反应的进行，腐败希瓦氏菌对U的还原活性逐步被激发。此外，还说明大多数U(Ⅵ)在还原成U(Ⅳ)之前先与腐败希瓦氏菌发生吸附反应，U(Ⅵ)与腐败希瓦氏菌的吸附反应较生物还原反应快得多。

图4 腐败希瓦氏菌固定U(Ⅵ)过程中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的变化Fig.4 Variation of ratio of U(Ⅳ)/U(Ⅵ) in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

2.2 EPS中的铀含量

从腐败希瓦氏菌中提取的EPS中U的含量在很大程度上取决于提取过程中EPS的提取效率和不溶性U(Ⅳ)的再溶解程度。采用CER法、超声波法和离心法3种方法提取的EPS中U的含量和UEPS/TUcells比示于图5。从图5可看出，离心法和超声法所得EPS中铀含量(UEPS)较低，离心法中UEPS为(0.42±0.09) mg/L，超声法中UEPS为(0.85±0.15) mg/L，这一结果与EPS提取效率[27]一致，由于其对EPS提取效率较低导致UEPS的含量低。对于CER法，UEPS在很大程度上取决于萃取时间。但随着萃取时间的延长，不溶性U(Ⅵ)的再溶解也变得严重，在本研究小组之前的研究中，当萃取时间为1 h、转速为600 r/min时，U(Ⅵ)再溶解的程度是可接受的[24]，CER法中UEPS为(2.91±0.22) mg/L，占腐败希瓦氏菌固定总铀量(TUcells=(20.7±0.71) mg/L)的(14.0±1.0)%。对比3种方法，离心法和超声法的铀提取效率低，不适用于EPS中铀的种类和含量的测定，CER法得到的结果可能更接近EPS中的实际铀含量。以上结果表明，用腐败希瓦氏菌固定铀时，EPS具有很强的富集能力，EPS中的铀含量不可忽略。

图5 从腐败希瓦氏菌中提取的EPS中的铀含量和UEPS/TUcells比Fig.5 UEPS and UEPS/TUcells ratio of EPS solution extracted from Shewanella putrefaciens

2.3 EPS中的颗粒铀

CER法适合用于表征EPS中的铀含量及形态。EPS中可溶性铀和颗粒铀的百分比，以及颗粒铀的粒径分布列于表1。EPS中可溶性铀的百分比在初始阶段(t=8 h)明显上升，然后随着铀固定反应的进行逐步下降，说明初始阶段EPS中主要发生铀酰离子的吸附，然后溶解态粒子逐步发生生物还原或生物矿化转化为铀颗粒。当反应进行到44 h时，颗粒铀占EPS中固定总铀量的66.6%，表明反应结束时颗粒铀是EPS中铀的主要形式。这一结果与William等[28]的研究结果一致，ShewanellaoneidensisMR-1的EPS与U(Ⅵ)反应形成了约3.0 nm的铀矿。CER法提取的EPS中颗粒铀较超声法和离心法多，进一步说明CER法对铀的萃取效率较高。

表1 EPS中可溶性铀和颗粒铀的百分比及颗粒铀的粒径Table 1 Fraction of soluble and particulate U and size of particulate U in EPS

CER法提取的EPS中铀颗粒的粒径分布示于图6。由图6可见，铀粒子随时间的推移逐渐形成铀颗粒并增大，颗粒数从3 144 mL-1增加到87 460 mL-1，平均粒径从13.5 nm增加到126.9 nm。在腐败希瓦氏菌固定U(Ⅵ)的初期，EPS中铀颗粒的数量减少，平均粒径增大，但EPS中铀含量略有增加，表明较小的铀粒子聚集并长大，在EPS中随时间积累。需要注意的是，ICP-MS得到的铀粒子的直径以铀原子计，不是含铀粒子的真实直径。然而由于铀原子远大于磷、氧等原子，所以该直径非常接近实际粒子的真实尺寸。

图6 CER法提取的EPS中铀颗粒的粒径分布Fig.6 Size distribution of nano-sized U particles in EPS extracts by CER method

上述结果表明，腐败希瓦氏菌的EPS在与U(Ⅵ)反应后，含有铀酰离子和铀矿物，说明EPS固定U(Ⅵ)过程中发生了生物吸附和生物矿化作用。

2.4 EPS对U(Ⅵ)的吸附机理

图7 EPS与铀作用前后的红外光谱Fig.7 FT-IR spectra of EPS before and after reaction with U(Ⅵ)

3 结论

1) 在处理过含铀地下水的腐败希瓦氏菌EPS中发现大量铀，占腐败希瓦氏菌固定铀总量的(14.0±1.0)%(CER提取法)。

2) SP-ICP-MS分析表明，EPS结合的铀有两种形态：溶解态和颗粒态。除生物吸附外，生物矿化也有助于腐败希瓦氏菌的EPS固定铀。

3) FT-IR分析结果说明，EPS吸附U(Ⅵ)时主要与EPS中的羧基官能团结合。