宁夏贺兰山东麓赤霞珠葡萄籽提取物抑菌活性的研究*

陈 彬 刘永衡 王学英

（宁夏工商职业技术学院能源化工学院，宁夏银川 750021）

近年来，宁夏葡萄产业发展迅速，宁夏贺兰山东麓成为业界公认的世界上最适合种植酿酒葡萄和生产高端葡萄酒的黄金地带之一。2021 年1 月，宁夏九大重点产业之一葡萄酒产业的高质量发展实施方案出台，其总体任务是力争用5—10 年时间，酿酒葡萄基地规模达到666 7 万公顷，年产优质葡萄酒3 亿瓶以上，努力实现葡萄酒产业综合产值1 000亿元、贺兰山东麓葡萄酒品牌价值翻番的目标。随着葡萄种植、加工产业的发展，产生了大量的葡萄皮渣据估计，目前每年产生约占葡萄加工量25%左右的皮渣。张莹等研究表明，酿酒后的葡萄皮渣中含有大量花色苷、白藜芦醇、膳食纤维等功能性成分，具有良好的医疗、保健作用。然而只有少量的皮渣被回收利用，绝大部分被用做肥料、饲料甚至当垃圾处理掉，造成了资源的极大浪费。同时，随着人们对食品安全问题愈加重视，使得从草药、香料等植物中提取天然抗菌化合物的研究也愈加迫切。本试验选用宁夏贺兰山东麓产区赤霞珠葡萄籽为材料，对不同溶剂提取物的抑菌效果进行了对比研究，旨在为深入研究葡萄籽的抑菌活性机理及其在食品保鲜中的应用提供一定的理论基础，也为提升葡萄酒酿造产品附加值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

酿酒葡萄：赤霞珠由宁夏西夏王葡萄酒业（集团）有限公司提供。

菌株：供试菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），试验室低温保存。

1.1.2 试剂

营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨（购自北京奥海星生物技术有限公司）、氯化钠、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心），均为国产AR 级别试剂。

1.1.3 仪器

R-3 旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司；SPX-150B-Z 型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD 型无菌操作台，上海博讯实业有限公司；PHSJ-4F 型试验室pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；梅特勒ME3002E 型分析天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；T6 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验样品制备

采用传统工艺酿造葡萄酒后收集皮渣，于烘箱中60 ℃～70 ℃烘干，分离葡萄籽和葡萄皮。将葡萄籽研磨至粉末状，浸渍于95%乙醇，避光密闭保存1 个月，备用。取葡萄籽95%乙醇浸渍液减压蒸馏除去溶剂后得265.3 g 粗浸膏（即95%乙醇总提取物样品），将粗浸膏溶于1 L 温水中（60 ℃），再用石油醚（60 ℃～90 ℃）、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取溶剂均为1 L。石油醚萃取层减压浓缩得18.5 g 浸膏（即95%乙醇总提取物石油醚萃取样品），乙酸乙酯萃取层减压浓缩得10.2 g 浸膏，正丁醇萃取层减压浓缩得26.3 g 浸膏。各提取浸膏用二甲基亚砜DMSO 溶解，制备成5 g/mL 的原始溶液，保藏备用。

1.2.2 供试菌株的活化及平板涂布培养

制备牛肉膏蛋白胨培养基，在121 ℃、0.1 Mpa～0.15 Mpa 条件下高压灭菌30 min，一部分制备试管斜面培养基，接种供试菌种后置于恒温培养箱内37 ℃培养24 h。另一部分制备平板培养基，挑取斜面培养菌落于EP 管中，接种于250 mL 三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中37 ℃振荡培养12 h 后，将菌液取出，无菌水稀释成浓度为每毫升106 个细胞的菌液，即OD 值0.5～0.6 的菌液。取5 mL 稀释菌液分散涂布于直径100 mm 培养皿上，恒温培养箱内37 ℃培养12 h。

1.2.3 抑菌圈及抑菌效果的评价方法

抑菌试验采用滤纸片扩散法，将1.2.1 中DMSO溶解试验样品溶液分别配成质量浓度为1.0 g/mL、0.50 g/mL、0.25 g/mL 的标准溶液。用打孔器制作直径5 mm 滤纸圆片，高压灭菌后将滤纸片放入各浓度试验样品溶液中浸泡30 min，以浸泡过DMSO 溶液的滤纸片作为空白对照（CK），干燥备用。无菌条件下，将供试样品浸泡干燥滤纸片用无菌镊子放置在含菌平板上，每个平皿放置4 片，且间隔一定的距离，然后将培养皿置于恒温生化箱37 ℃培养24 h，最后观察菌落生长情况，并用精密测量尺测定抑菌圈直径。

抑菌活性大小依据抑菌圈试验判定标准：即抑菌圈直径大于20 mm，为极度敏感；抑菌圈直径介于15 mm～20 mm 之间，为高度敏感；抑菌圈直径介于10 mm～14 mm 之间，为中度敏感；抑菌圈直径介于7 mm～9 mm 之间，为低度敏感；小于7 mm为不敏感；直径越大抗菌活性越强。

1.3 数据处理与分析

所有试验重复3 次，利用Excel2007、IBM SPSS Statistics 19 进行数据统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 石油醚萃取物抑菌效果

赤霞珠葡萄籽95%乙醇总提取物石油醚萃取物在质量浓度为0.20 g/mL、0.10 g/mL、0.05 g/mL3 个水平下对3 种典型细菌的生长有一定的影响，结果如下页表1 所示。

从表1 中可以看出，石油醚萃取物质量浓度为0.20 g/mL、0.10 g/mL 时对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，达到了中等抑菌效果，而当质量浓度为0.05 g/mL 时抑菌作用不明显。石油醚萃取物对大肠杆菌抑菌作用不明显，在0.20 g/mL、0.10 g/mL 浓度下，虽然表现出一定的抑菌作用，但抑菌圈直径均小于7 mm，说明大肠杆菌对这2 个浓度的萃取物不敏感。同样，枯草芽孢杆菌对3 个浓度梯度的样品液均不敏感。

表1 赤霞珠葡萄籽95%乙醇总提取物石油醚萃取物的抑菌活性

2.2 乙酸乙酯萃取物抑菌效果

从表2 中可以看出，乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌没有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在样品质量浓度为0.20 g/mL 时表现出较弱的抑制作用，低于0.20 g/mL 时无抑菌效果。

表2 葡萄籽95%乙醇总提取物乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

2.3 正丁醇萃取物抑菌效果

从表3 中可以看出，正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌表现出明显的抑菌效果，样品质量浓度为0.20 g/mL 时，抑菌圈的直径到达21.3 mm 以上，表现出极强的抑菌效果，样品质量浓度为0.05 g/mL时，抑菌圈直径在15 mm～20 mm 之间，说明对菌体高度敏感。质量浓度为0.20 g/mL、0.10 g/mL 正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与对大肠杆菌的抑菌效果无显著差异，但对枯草芽孢杆菌的抑菌效果具有显著差异；质量浓度为0.05 g/mL 的样品对3 种菌种的抑菌效果均具有显著性差异。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对正丁醇萃取物的敏感性明显强于枯草芽孢杆菌。

表3 葡萄籽95%乙醇总提取物正丁醇萃取物的抑菌活性

2.4 赤霞珠葡萄籽各溶剂萃取物的抑菌活性分析

赤霞珠葡萄籽各极性萃取物在质量浓度为0.20 g/mL 时对3 种典型的腐败菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的抑菌活性结果如下页图1 所示。

由图1 可知，赤霞珠葡萄籽各极性萃取物对三种典型腐败菌的抑菌能力由强到弱为：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物，结果表明，发挥主要抑菌能力的活性成分主要集中在高极性的正丁醇萃取物中，因此，在后续分析、分离及应用研究中，可将正丁醇萃取物作为重点研究对象。

图1 赤霞珠葡萄籽各溶剂萃取物的抑菌活性

3 讨论

植物提取物对不同微生物有不同程度的抑制效果，同一种植物提取的活性物质对不同细菌的抑制程度不一样，同一细菌对不同提取物的敏感性亦有差异。Subramanian M 等研究表明，葡萄籽中含有的白藜芦醇等酚类化合物具有抑菌活性；此外，葡萄籽中含有的原花青素也属于多酚类化合物，也具有一定的抑菌活性。本试验研究了赤霞珠葡萄籽不同溶剂提取物对3 种典型细菌的抑菌效果，结果表明，葡萄籽95%乙醇总提取物石油醚萃取物对革兰氏阳性菌（特别是金黄色葡萄球）抑菌活性强，对革兰氏阴性菌抑菌效果较弱；葡萄籽95%乙醇总提取物正丁醇萃取物对3 种典型菌表现出较强的抗菌活性，这可能是由于正丁醇萃取物含有大量生物碱、多酚之类的大极性化合物，对细菌有较明显的广谱抑菌作用；与正丁醇、石油醚萃取样品相比，乙酸乙酯萃取物对3 种细菌的抑菌效果最差。各极性萃取物的抑菌能力由强到弱为：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物。枯草芽孢杆菌对所有样品溶液的敏感性均弱于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，这可能是因为芽孢对外界不良环境抵抗能力较强的缘故。

赤霞珠品种在宁夏贺兰山东麓地区的种植面积占到红色品种的70%以上，本试验对赤霞珠葡萄籽提取物的抑菌活性进行了初步研究，为葡萄籽的开发利用及其作为抑菌剂在食品保鲜加工中的应用提供一定的理论基础。