1%鸡红细胞悬液4℃保存期限试验

王苹 赵明娟 崔鸿博

(北京市怀柔区动物疫病预防控制中心 101400）

1%鸡红细胞悬液是采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验检测新城疫病毒、禽流感病毒、禽腺病毒Ⅲ群（减蛋综合征病毒）、传染性支气管炎病毒等病原微生物血凝抑制抗体的重要试剂[1]，红细胞的凝集状态直接影响试验结果的判定，不同条件下、不同浓度、不同保存方法都会影响试验结果的准确性[2-4]。因此，准确配制及合理保存红细胞悬液是保证试验结果准确的一项重要环节。在基层实验室，送检的每份鸡血清样品一般需检测新城疫、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H5亚型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亚型（Re-12 株）4 种抗体效价，每份水禽血清样品也需检测禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H5亚型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亚型（Re-12 株）3种抗体效价。由于检测种类多，检测样品数量大，不可能一天完成，但如果每次试验都重新制备1%红细胞悬液会增加工作量，因此，实验室检测人员一般都选择一次制备足够一批次检测试验所需量的1%红细胞悬液，于4℃保存，分批次使用。笔者通过试验观察1%红细胞悬液在4℃环境下保存时间对新城疫及禽流感血凝抑制试验抗原效价的影响，确定了最佳保存时间，仅为广大基层实验室检测人员提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验设计

采用自制1%鸡红细胞悬液，分别测定鸡新城疫血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H5亚型（Re-11 株）血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H5亚型（Re-12 株）血凝抑制试验抗原4 种抗原效价，每种抗原每次试验设4 个重复，分别记录1%鸡红细胞悬液在4℃环境下保存1、2、3、4、5、6、7d 时测定的4 种抗原效价，每种抗原用PBS 稀释后分装成小份，于-20℃保存，每次试验取一份检测其效价。

1.2 试验仪器设备

12 道多道移液器（5～50μl），单道移液器（5～50μl），一次性吸头，冷藏柜（4℃）、微量振荡器、90。一次性微量反应板、一次性加样槽。

1.3 试验试剂

新城疫血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：20180824），禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：2019006），禽流感病毒H5亚型（Re-11 株）血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：2019006），禽流感病毒H5亚型（Re-12 株）血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：2019006），1×PBS缓冲液 (pH7.2～7.4，0.01mol/L)（HyClone，产品有效期至：2020 年8 月），红细胞保存液（Solarbio，生产批号：20190328），1%鸡红细胞悬液（自制）。

1.4 试验方法

1.4.1 1%红细胞悬液制备

（1）于50ml 洁净的无菌带盖离心管中加入约7ml 阿氏液，用5mL 一次性无菌注射器从翅静脉处采集3～10 周龄SPF 鸡(最少两只) 血约5ml，与阿氏液于离心管中轻轻混合均匀。

（2）加入3～4 倍体积的PBS 混匀，以1800r/min 离 心8min，弃上清液和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，重复以上过程，反复洗涤3 次(洗净血浆和白细胞)。

（3）最后吸取1 倍体积(ml) 的红细胞，加入99 倍体积(ml) 的PBS，均匀混合，分装于50ml 三角瓶中，4℃保存备用。

1.4.2 血凝（HA）试验操作步骤

（1）取90。一次性微量反应板，用微量移液器在1～12 孔均加入0.025ml PBS，换吸头。

（2）吸取0.025ml 病毒悬液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混匀。

（3）从第1 孔吸取0.025ml 混匀后的病毒液加入第2 孔，混匀后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11 孔吸取0.025ml 弃之，设第12 孔为PBS 对照。

（4）每孔再加入0.025ml PBS。

（5）每孔再加入0.025ml 体积分数为1%鸡红细胞悬液。

（6）震荡均匀，在室温20～25℃下静置约40min，PBS 对照孔的红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。

（7）结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。

1.4.3 回归试验操作步骤[5]

（1）取90。一次性微量反应板，用微量移液器在1～4 孔均加入0.025ml PBS，换吸头。

（2）吸取0.025ml 配制好的4HAU 病毒悬液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混匀。

（3）从第1 孔吸取0.025ml 混匀后的病毒液加入第2 孔，混匀后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此进行对倍稀释至第4 孔，从第4 孔吸取0.025ml 弃之。

（4）每孔再加入0.025ml 体积分数为1%鸡红细胞悬液。

（5）轻轻均匀，在室温20～25℃下静置约40min 后观察结果。

（6）结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。第1 孔、第2 孔完全血凝（不流淌）则抗原配制正确，否则应重新测定抗原血凝效价。

2 试验结果与分析

2.1 试验结果

测定的效价分别用回归试验检测，显示结果准确，查看附表。

附表 1%红细胞悬液在4℃保存1～7d 时血凝试验检测抗原效价结果

2.2 结果分析

试验结果显示，1%红细胞悬液在4℃保存第6 天开始出现溶血，静置后的上清液由无色透明状出现浅粉红色，测定各种血凝抑制试验抗原的效价开始下降。因此，在开展血凝和血凝抑制试验时，为保证试验结果准确可靠，1%鸡红细胞悬液在4℃最多可保存5d，过期则不能使用。

3 讨论

3.1 红细胞悬液保存时间

由试验结果可知，制备好的红细胞悬液在4℃环境下保存5d 时，测得的抗原效价基本一致，不影响使用效果；第6 天抗原效价开始下降，说明红细胞悬液开始溶血，浓度开始下降，不能继续使用。

3.2 影响试验结果的因素

血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是新城疫和高致病性禽流感诊断技术之一[6,7]，4 单位病毒配制的准确性、抗原反复冻融次数、稀释液pH、被检血清状态、1%红细胞悬液配制方法、试验耗材、仪器设备、环境温度、检测人员操作手法等因素都会对试验结果造成影响[8]，因此，整个试验的每个环节都应严格按照操作标准进行，尽量减少试验误差。

3.3 红细胞悬液配制过程中的注意事项

采集的血液与阿氏液混合时应将血液沿离心管壁缓慢注入，不能直接垂直打入；在洗涤红细胞过程中，离心机转速不要超过2000r/min，每次混匀操作动作要轻，避免剧烈震荡，否则易造成红细胞的破裂，造成溶血。

3.4 红细胞悬液保存注意事项

制备好的1%红细胞悬液于4℃保存时，最好分装成小份，每份仅供一次试验使用，避免反复冷藏及回温，减少红细胞破裂，延长保存时间。