温和气单胞菌高免血清制备初探

成建 江淑容 程勇 覃嘉豪 廖长水 李堂武

（1，重庆市长寿区动物疫病预防控制中心 401220；2，重庆市长寿区畜禽品种改良站 401220；3，重庆市长寿区龙河镇农业服务中心 401243；4，重庆市长寿区温氏畜牧有限公司 401231；5，重庆市长水禽业发展有限责任公司 401243；6，重庆市长寿区瑞康宠物医院 401220）

温和气单胞菌(Aeromonas sobria)，又称威隆气单胞菌温和生物型(A.veroniibv.sobria)，是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一，能引起鱼类、爬行类、两栖类等冷血动物的出血性败血症[1]。80 年代以来，国外有些学者发现，由此菌引起人胃肠炎和食物中毒，随着对肠毒素研究的深入，腹泻病人体内检出此菌日益增多，以后又发现其可引起人的败血症、腹膜炎、中耳炎、角膜炎及其他化脓性疾病，是人兽共患病原菌[2]。目前，对温和气单胞菌疫苗研究已有不少报道，但对温和气单胞菌氢氧化铝灭活苗研究甚少。本试验在温和气单胞菌灭活加入氢氧化铝佐剂制成氢氧化铝灭活苗，免疫家兔，制备高免血清。用凝集试验检测抗体效价，为该菌的免疫学检测及防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

温和气单胞菌菌株、普通肉汤培养基及马丁琼脂培养基、甲醛、氢氧化铝、硫柳汞、12 只1.5～2kg 非免疫家兔。

1.2 试验器材

SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台、空气浴振荡器（HZQ-C 型）、冰箱（BCD—212 型）、隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS 型）、分光光度计（2100 型&UV-2100 型。

1.3 方法

（1）温和气单胞菌的培养:将温和气单胞菌接种于马丁琼脂培养基，28℃培养24h，然后接种单个菌落于5ml 普通肉汤28℃振荡培养24h，最后将普通肉汤菌液倒入100ml 锥形瓶普通肉汤中28℃振荡培养24h。

（2）温和气单胞菌液灭活：甲醛与菌液按0.4%的比例均匀混合在28℃振荡培养24h，接种菌液于普通培养基28℃培养24h 检验是否灭活，并用分光光度计检验此菌液OD 值。

（3）氢氧化铝灭活苗的制备：将氢氧化铝佐剂和灭活菌液按1：4 的比例均匀混合制成灭活苗，分装入无菌青霉素瓶子，4℃冰柜中保存备用。

（4）免疫：取非免疫家兔12 只，随机分成3 组，每组4只，按下列免疫程序进行免疫。

试验Ⅰ组：按照第1 天0.5ml、第14 天注射1.0ml、第28天注射1.5ml、第42 天注射2.0ml，分别采用颈部皮下注射氢氧化铝灭活苗。

试验Ⅱ组：按照第1 天1.0ml、第14 天注射1.5ml、第28天注射2.0ml、第42 天注射2.5ml，分别采用颈部皮下注射氢氧化铝灭活苗。

对照组：同样条件饲养，不注射。

（5）血清的分离与保存：试验组和对照组分别在第一次、第二次、第三次免疫7d 后采取耳静脉采血和第四次免疫14d后采取心脏采血，常温下静置，待血液完全凝固后置4℃冰箱过夜析出血清，按0.01%的比例加入硫柳汞防腐，充分混匀后按3ml 每瓶分装到无菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存备用。

（6）检测抗原的制备：将温和气单胞菌接种于5ml 普通肉汤，在28℃的条件下振荡培养24h 后，将菌液转入盛装有50ml普通肉汤的三角烧瓶中，在28℃的条件下振荡培养24h 取出。加入0.2ml 甲醛于50ml 菌液中振荡培养24h，接种菌液于普通培养基28℃培养24h 检验是否灭活，并用分光光度计检验此菌液浓度OD 值。分装入无菌青霉素瓶子，放置4℃冰柜中保存备用。

（7）高免血清效价的测定：采用凝集试验检测血清效价。

待检组：0.5%苯酚生理盐水50ul 加被检血清50ul 按照1：2，1：4，1：8.1：16……1：4096 的比例进行稀释，最后一孔弃去50ul，再加上50ul 抗原。

抗原对照组：分别加0.5%苯酚生理盐水50ul 与抗原50ul。

阴性对照组：分别加被检血清50ul 与抗原50ul，3 组均在37℃下20min 观察结果。

2 试验结果

（1）本试验所制备的疫苗和检测抗原均无细菌生长，因此，本试验制备的疫苗和检测抗原已灭活。

（2）本试验制备的疫苗和检测抗原OD 值在波长540nm 调整为1 (OD 值为1 细菌个数约为1×1010/ml)。

（3）高免血清效价结果：各组分别在第一次、第二次、第三次免疫后7d 检测抗体效价和第四次免疫后14d 检测抗体效价。经4 次免疫后试验Ⅰ组抗体效价为1：1024，试验Ⅱ组抗体效价1：512，对照组没有检测到抗体效价。具体结果见表1、表2。

表1 试验Ⅰ组抗体效价结果

表2 试验Ⅱ组抗体效价结果

结果判定：用“+”表示反应强度。

#：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底,振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。

+++：液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。

++：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物。

+：液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹。

-：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。

3 分析讨论

（1）本试验用温和气单胞菌氢氧化铝灭活苗免疫家兔制备高免血清，采用凝集试验检测温和气单胞菌抗体效价。采用两种不同的免疫程序进行4 次免疫后，无菌分离血清，测得试验Ⅰ组温和气单胞菌的效价为1∶1024。试验Ⅱ组温和气单胞菌的效价为1∶512。对照组没有检测到温和气单胞菌抗体。从本试验看，温和气单胞菌灭活苗能刺激家兔机体产生抗体，本试验采用的免疫方法可以使这些物质刺激机体产生抗体。

（2）从试验结果可以看出，试验Ⅰ组的效价比试验Ⅱ组效价高，而试验Ⅱ组的免疫剂量比试验Ⅰ组免疫剂量大。按照常理是抗原剂量越大抗体滴度越高，存在这一结果的原因可能有家兔个体生理差异；试验Ⅱ组的免疫剂量可能过大。

（3）在实际生产中以往对温和气单胞菌的分离鉴定多采用生化实验，操作技术烦琐，项目多达几十种，鉴定成本高昂，且观察时间较长，常给实验诊断带来困难[3]。温和气单胞菌高免血清的制备为该菌的免疫学检测及防治提供依据。

（4）目前，检测抗体的方法很多，如血凝及血凝抑制试验、免疫荧光试验、血清中和试验等。但用96 孔“U”形微量反应板上进行凝集试验所需设备简单，操作方便、易行，凝集现象明显，易于观察。于是本次试验在96 孔“U”形微量反应板上进行凝集试验检测血清抗体效价。

4 结论

从本试验看，温和气单胞菌制备灭活苗后免疫家兔能产生抗体。试验Ⅰ组的免疫剂量明显小于试验Ⅱ组，而试验Ⅰ组的效价为1：1024，试验Ⅱ组的效价为1：512，试验Ⅱ组效价明显小于试验Ⅰ组效价，因此，我们认为试验Ⅰ组的注射剂量更适合免疫。