光学法血小板计数在小红细胞性贫血患者中的应用

王楠 谭俊青 钟广智 黄静蓉 李冉 黎翠翠

1广东省第二中医院检验科，广州 510095；2广州华银医学检验中心 510663

血常规是临床常规检查项目，血小板计数更是其中一项重要指标。血小板准确计数对临床诊断和治疗疾病具有重要意义［1］。目前临床实验室血小板计数普遍采用全自动血细胞分析仪电阻抗法［2］。但其结果易受小红细胞、异常血小板（比如大血小板、形状不规则的血小板、血小板聚集）、脂肪乳、红细胞碎片或白细胞碎片等干扰，影响血小板计数的准确性［3-8］。本实验的日本SYSMEX XE-5000i全自动血液分析仪除电阻抗法还可用光学法进行血小板计数。本研究以手工法作为金标准，分别用光学法和电阻抗法对EDTA-K2抗凝全血标本进行血小板计数，对3种方法的计数结果进行比较及相关性分析，探讨光学法血小板计数在小红细胞性贫血患者中的应用。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集广东省第二中医院2019年12月至2020年3月就诊小红细胞性贫血患者的含EDTA-K2抗凝全血标本109份，均获得患者知情同意。根据平均红细胞体积（MCV）大小分成3组，其中MCV＜70 fl的标本43份，再按红细胞分布宽度（RDW）大小进行分组，RDW＜17%为正常组，RDW≥17%为异常组；70 fl≤MCV＜80 fl的标本32份；MCV≥80 fl的标本34份。标本选用无溶血、无脂血、无凝块含EDTA-K2抗凝全血标本。标本采集时，应避免因采血不畅而导致血小板被破坏，引起血小板计数假性降低。在采集后2 h内完成检测。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 手工法日本OLYMPUS双目显微镜，牛鲍改良血细胞计数板，瑞氏染液，血小板稀释液按《全国临床检验操作规程》（第4版）［9］的要求配制。

1.2.2 电阻抗法和光学法日本SYSMEX XE-5000i全自动血液分析仪及其原装配套的试剂和质控品。

1.3 检测方法

1.3.1 手工法方法参考《全国临床检验操作规程》（第4版）的血小板计数。先对血液进行上下颠倒混匀10次，取一支试管加入0.38 ml的1%草酸铵溶液，接着用移液枪吸取20 μl血液加入试管震荡混匀，静置至溶血后再混匀，制成血小板悬液；然后用微量采血管取一滴血小板悬液进行充池，静置15 min，当血小板充分下沉后由2名检验人员采用双盲法进行计数，分别计算4个角落和中央共5个中方格，最后根据公式计算结果。每份标本计数2次取其平均值；取一滴血液标本滴于载玻片右端，取另一张载玻片作为推片。推片与载玻片呈45°，推片末端置于血滴左侧，缓慢地向后拉，使之与血液接触，然后向前推片，动作要平稳使血液在载玻片上形成一层均匀的薄血膜，且要求头尾分明。用手轻扇使血膜快速干燥，然后再用瑞氏染料按照其说明书对血膜进行染色。待玻片干燥后在显微镜下观察排除异常血小板、血小板聚集等现象的标本［9］。

1.3.2 电阻抗法和光学法采用日本SYSMEX XE-5000i全自动血液分析仪，按照仪器操作规程进行质控和标本检验。标本检验采用模式5（CBC+RET），该方法可在血小板参数同时查看电阻抗法和光学法的数据。

1.4 统计学方法用SPSS Statistics v23 x86软件对数据进行数据处理与统计分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（）表示，3种方法血小板计数结果比较，先采用完全随机设计方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。相关性分析采用Person相关系数进行分析，r＞0.95认为存在显著性相关，r＞0.80认为高度相关。

2 结 果

2.1 3种方法血小板计数结果比较MCV＜70 fl时，电阻抗法与手工法比较结果较高，差异有统计学意义（P＜0.05），光学法与电阻抗法比较结果较低，差异有统计学意义（P＜0.01），光学法与手工法比较差异无统计学意义（P＞0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl时，电阻抗法和光学法与手工法比较结果差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 小红细胞性贫血患者全血标本3种方法血小板计数结果比较（×109/L，）

表1 小红细胞性贫血患者全血标本3种方法血小板计数结果比较（×109/L，）

注：MCV为平均红细胞体积；与手工法比较，aP＜0.05；与电阻抗法比较，bP＜0.01

MCV MCV＜70 fl 70 fl≤MCV＜80 fl MCV≥80 fl P值0.003 0.731 0.340份数43 32 34手工法315.162±63.765 288.091±73.942 283.762±75.255电阻抗法341.423±92.312a 290.696±102.267 278.213±74.401光学法320.633±77.014b 285.166±82.878 281.712±65.713 F值4.271 0.352 0.973

2.2 3种方法血小板计数结果相关性分析MCV＜70 fl时，电阻抗法与手工法、光学法与手工法及电阻抗法与光学法血小板计数结果的相关系数r分别为0.914、0.921和0.945；70 fl≤MCV＜80 fl时，r分别为0.935、0.943和0.978；MCV≥80 fl时，r分别为0.926、0.888和0.962。见表2。

表2 小红细胞性贫血患者全血标本3种方法血小板计数结果相关性分析（r值）

2.3 MCV＜70 fl时不同RDW分组3种方法血小板计数结果比较当MCV＜70 fl时，进一步按RDW进行分组，RDW＜17%为正常组，RDW≥17%为异常组。当RDW＜17%时，电阻抗法与手工法结果比较差异有统计学意义（P＜0.05），光学法与手工法比较差异无统计学意义（P＞0.05）；当RDW≥17%时，电阻抗法和光学法与手工法结果比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表3。

表3 MCV＜70 fl时不同RDW分组小红细胞性贫血患者全血标本3种方法血小板计数结果比较（×109/L）

表3 MCV＜70 fl时不同RDW分组小红细胞性贫血患者全血标本3种方法血小板计数结果比较（×109/L）

注：MCV为平均红细胞体积，RDW为红细胞分布宽度；与手工法比较，aP＜0.05，bP＜0.01

RDW RDW＜17%RDW≥17%P值0.012 0.005份数29 14手工法296.666±63.981 338.142±55.393电阻抗法316.342±86.147a 393.367±85.101b光学法298.863±71.045 365.710±71.033b F值2.939 3.078

3 讨 论

随着医学技术的提高，人们越来越追求更便捷更准确的检查方法。目前血小板计数常用的方法有手工法、电阻抗法、光学法、荧光染料结合法和流式细胞术［10-12］。

早期血小板计数采用手工法，对时间有一定要求，要求检测人员经过严格的专业训练以及丰富的工作经验，虽容易受主观因素影响，但其优点也不可忽视［13］。手工法可以排除其他细胞比如小红细胞、异常血小板比如大血小板，形状不规则的血小板、脂肪乳、红细胞碎片或白细胞碎片以及EDTA-K2依赖的血小板聚集对血小板计数的干扰［14］。随着医学技术的提高和标本量增加，全自动血液细胞计数仪得到了普遍和广泛的应用［6］。电阻抗法测血小板是通过阻抗信号来进行细胞分类的，电阻抗信号越小，细胞的直径就越小，与细胞内容物无关，只与细胞直径相关。与手工法相比，电阻抗法检测时间较短，操作更简便。光学法是通过接收到的前向散射光和侧向散射光信号，前者与细胞大小相关，后者与细胞内容物结构相关，然后综合分析对细胞进行分类。所以光学法与电阻抗法相比，前者可以排除因为红细胞碎片，小红细胞引起的血小板计数产生的误差［4，15-17］。荧光染料结合法是利用荧光染料来计数血小板。荧光染料结合法比光学法测得血小板更多，光学法只能测得成熟的血小板，荧光染料结合法还可以测未成熟血小板。而且荧光染料结合法也可以排除血细胞碎片，小红细胞、异常血小板对血小板计数的干扰。流式细胞术利用抗原抗体结合来区分血小板与其他细胞，具有较强的特异性，但对于抗体的要求较高，要求抗体能识别所有的血小板，因此对技术和成本要求比较高，不利于在常规筛查中应用［18］。

有研究表明，在血细胞形态正常及无溶血、脂血、血小板凝集的情况下，手工法、电阻抗法、光学法都可以满足日常检测的需要［19］。在面对血细胞形态正常的标本时，电阻抗法和光学法都有良好的重复性和准确性，虽然存在不同程度的误差但在可允许范围内。但是对于小细胞性贫血患者的标本来说，里面含有的小红细胞会对电阻抗法血小板计数进行干扰，由于方法学的局限性，电阻抗法会将小红细胞误认为是血小板，使血小板假性升高。光学法利用接收到的前向散射光和侧向散射光信号从而区分血小板和小红细胞，可避免出现误判。所以在面对这一类标本时，在没有血小板聚集的情况下，光学法要优于电阻抗法［20-22］。

本研究首先以MCV进行分组，发现3组之间血小板计数结果均具有良好的相关性。MCV＜70 fl时，电阻抗法与手工法比较结果偏高，差异有统计学意义（P＜0.05）；电阻抗法与光学法比较结果较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl时，电阻抗法和光学法与手工法结果比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），研究结果与报道相符。因此，对于MCV≥70 fl的标本，临床常规采用全自动血细胞分析仪电阻抗法进行血小板计数对结果无影响。

对于MCV＜70 fl的标本，手工法镜检发现部分血片可见红细胞大小不均、红细胞碎片、椭圆形红细胞、靶形红细胞等。有研究报道，RDW异常也会对血小板计数造成影响［23-24］。因此，当MCV＜70 fl时，我们进一步以RDW进行分组，RDW＜17%为正常组，RDW≥17%为异常组。当RDW＜17%时，电阻抗法与手工法血小板计数结果比较差异有统计学意义（P＜0.05），光学法与手工法比较差异无统计学意义（P＞0.05）；当RDW≥17%时，电阻抗法和光学法与手工法结果比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。结果提示，当MCV＜70 fl、RDW＜17%时，小红细胞干扰会导致电阻抗法血小板计数偏高，应采用光学法或手工法复检；但MCV＜70 fl、RDW≥17%时，小红细胞大小不均也可影响光学法血小板计数，应采用手工法复检。

本研究由于样本量有限，下一步应扩大样本容量，尽量降低代表性误差带来的影响。本研究的目的是探讨光学法在小红细胞性贫血患者中的应用，在面对这一类标本时，光学法要优于电阻抗法。但是在出现MCV＜70 fl且RDW≥17%、血小板直方图出现异常或细胞计数仪结果出现提示血小板聚集时建议采用手工法进行血小板计数，必要时可涂片染色镜检。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。