基于海马区BDNF的变化研究电针调控外源性NSCs治疗PSCI的作用及机制

陈吉祥 张瑾 张顺喜 王世雄 任静 李国燕 陈俊辉

广州市第一人民医院康复医学科 510180

卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指脑卒中后6个月内出现达到认知障碍诊断标准的一系列综合征［1］。国内外相关研究显示，脑卒中后47.30%～80.97%患者发生PSCI［2-3］。PSCI不仅影响脑卒中患者对外界环境的感知和适应能力，同时严重阻碍患者运动、语言、吞咽等各方面功能的恢复，成为制约脑卒中患者全面康复的关键因素［4］。目前，PSCI常用治疗方法主要包括药物疗法以及认知康复训练，虽然这些方法具有一定疗效，但总体而言疗效较有限，且对于重症患者疗效不佳［5-6］。近年，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植有望成为改善PSCI、治疗脑卒中的新技术［7］。但是，NSCs移植存在细胞存活率低，向损伤部位迁移和分化不足的问题，如何调控NSCs并阐明其作用机制对NSCs移植改善PSCI、治疗脑卒中具有重要科学意义［8］。前期研究表明，电针可促进大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠海马区内源性NSCs的增殖和分化改善PSCI［9］，表明电针具有调节内源性NSCs作用，那么，电针是否能通过调节外源性NSCs向认知相关脑区迁移和分化治疗PSCI？此外，微环境对NSCs的存活、迁移和分化至关重要［10］，而我们前期研究也表明，电针具有调节NSCs微环境中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作用［11］，那么电针是否基于调节BDNF从而调控外源性NSCs的迁移和分化？本研究拟通过认知评估和蛋白检测技术等初步探讨该科学问题，以期为改善PSCI、促进脑卒中患者全面康复提供电针+NSCs移植这一新的治疗技术和理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器BDNF抗体（Abcam）；二氨基联苯胺（DAB）免疫组化试剂盒（福州迈新生物科技有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体以及辣根过氧化物酶二抗（Cell Signaling Technology，USA）；Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；Image-lab图像分析系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 实验动物及分组雄性健康成年无特殊病原体（SPF）级SD大鼠，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，体质量（230±20）g，6～8周龄，实验前适应性饲养1周。参照此前发表文章中所采用的改良Zea Longa方法［12］，制备左侧MCAO：大鼠称重后，用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，仰卧位固定、消毒、备皮，切开颈部正中皮肤，充分暴露并钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉。用动脉夹夹闭颈内动脉，然后在颈总动脉结扎处远端约3 mm处剪一小口，将备好的线栓经切口导入18～22 mm，撤去颈内动脉血管夹，缓慢推动栓线至大脑前动脉近端。固定栓线，缝合伤口，待缺血2 h后回抽栓线至颈总动脉分叉处，形成缺血再灌注模型。动物苏醒后观察其体态及行为，按Zea Longa评分标准评价动物的行为变化以判断MCAO是否成功。具体评分标准为：无神经功能缺失症状为0分；提尾倒悬时不能完全伸展右侧前爪为1分；行走时向偏瘫侧转圈（向右侧转圈）为2分；行走时向右侧倾倒为3分；不能自发行走，意识丧失评分为4分。评分为1～3分纳入实验，剔除0分、4分。共成功制备24只MCAO。将大鼠配对分为3组：模型组（8只）、NSCs移植组（8只）、电针+NSCs移植组（8只）；由于造模后部分大鼠死亡，最终各组取6只大鼠进行数据分析。

1.3 干预措施模型组只给予同等条件下饲养以及抓取固定，不给予其他治疗。NSCs移植组以及电针+NSCs移植组在造模术后第2天行NSCs移植治疗，其中NSCs移植组在NSCs移植后予同等条件下饲养以及抓取固定，电针+NSCs移植组在NSCs移植组基础上联合行电针治疗。电针参考《实验针灸学》［13］取大鼠百会穴，使用华佗牌30号0.5寸毫针，G6805电针仪，电压峰值6 V，以针体轻轻抖动为度，疏密波，频率1～20 Hz，20 min/次，1次/d，共电针治疗7 d。参考相关文献报道方法行NSCs分离、培养和移植［14］：取新生3 d的SD大鼠用于提取NSCs，将其喂养14 d后，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射进行麻醉，无菌条件下处死后取鼠脑，解剖显微镜下剥除脑膜、脑血管后，得到大脑海马组织，置于Hank’s液漂洗剪碎，机械吹打后形成细胞悬液。16 000 r/min，离心半径7.2 cm，离心5 min弃上清液，选取沉淀物继续吹打形成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×109/L后，将其接种于25 ml无菌培养瓶内。滴入含20 μg/L的表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+2% B27 DMEM/F12培养基后，置于37℃、体积分数5%CO2下培养，每3 d换液1次，至第10天细胞开始传代。选取传代后细胞接种于已涂5%多聚赖氨酸盖玻片培养板上，待细胞贴壁置于磷酸盐缓冲液洗5 min，免疫细胞化学法（ABC法）染色测定，将1：100浓度巢蛋白（nestin）抗体溶液测得阳性细胞作为NSCs。移植组大鼠造模成功后第2天进行NSCs移植，常规麻醉仰卧固定于手术台，选择脑立体定位仪对大鼠左侧脑室进行定位，坐标零点为前囟（Bregma）点，AP＝0.0 mm，ML＝2.0 mm，DV＝4.5 mm。微量注射器0.15 μl/s注入10 μl的NSCs，细胞浓度为2×1010/L，注射结束后留针20 min后拔出，电针+NSCs移植组选择相同方法移植。

1.4 Morris水迷宫实验参照我们此前发表文章中所采用的方法［12］，各组大鼠在造模手术后4～8 d进行Morris水迷宫实验：其中术后4～7 d连续4 d进行定位航行实验，观察其逃避潜伏期和游泳路径，评估大鼠的学习能力，4次/d，术后第8天进行空间探索实验，观察规定时间内大鼠穿越平台的次数，评估大鼠的空间记忆能力。具体实验包括：（1）定位航行实验。将大鼠按顺时针方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水点顺序面向池壁放入水中。记录90 s内寻找平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在90 s内找到平台，并停留3 s以上，记录90 s内实际逃避潜伏期；如果在90 s内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为90 s。（2）空间探索实验。定位航行实验全部结束后，次日进行空间探索实验。撤去平台，然后选第一象限与定位航行实验相同的入水点将大鼠面向池壁放入水中，分别记录90 s内大鼠穿越原平台相应位置的次数。Morris水迷宫监测全过程通过安装在Morris水迷宫上方的摄像机传入电脑并记录和储存，再运用行为轨迹跟踪系统软件进行分析和数据处理。

1.5 实验取材及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测取左侧海马组织置于液氮罐中速冻，再置于-80℃冰箱保存。1 ml裂解缓冲液和10 μl苯甲基磺酰氟（PMSF）储存液裂解100 mg左侧海马组织，充分研磨后离心，吸取上清。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，取50 μg样品蛋白经12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，用封闭液封闭2 h，分别用BDNF、β-actin一抗（1∶1 000）孵育，4℃过夜，TBST洗膜后，用辣根过氧化物标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。将PVDF膜放图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜，Image-lab图像分析系统分析处理。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0进行数据统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，所有数据均满足方差齐性（P＞0.05），两两比较采用LSD法；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫实验评估学习记忆功能的结果与模型组相比，NSCs移植组大鼠逃避潜伏期时间缩短，表明NSCs移植组大鼠的学习能力较模型组大鼠提高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与NSCs移植组及模型组相比，电针+NSCs移植组大鼠逃避潜伏期时间缩短，表明电针+NSCs移植组大鼠较NSCs移植组大鼠学习能力更佳，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组相比，NSCs移植组大鼠跨越平台次数增加，表明NSCs移植组大鼠的记忆能力较模型组大鼠提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与NSCs移植组及模型组相比，电针+NSCs移植组大鼠跨越平台次数增加，表明电针+NSCs移植组大鼠较NSCs移植组大鼠记忆能力更好，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 大脑中动脉闭塞模型大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数比较（）

表1 大脑中动脉闭塞模型大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数比较（）

注：模型组大鼠给予基础饲养以及同等条件抓取固定，NSCs移植组采用NSCs移植治疗，电针+NSCs移植组在NSCs移植基础上行电针百会穴治疗；NSCs为神经干细胞；与模型组相比，aP＜0.05，bP＜0.01；与NSCs移植组及模型组相比，cP＜0.05

逃避潜伏期（s）穿越平台次数（次）0.98±0.32 1.76±0.46b 2.28±0.35c组别模型组NSCs移植组电针+NSCs移植组只数第4天80.26±6.57 69.89±9.18a 58.56±8.64c 6 6 6第5天72.43±9.30 53.67±8.54a 50.66±9.20c第6天66.85±8.79 44.53±7.45b 39.43±7.39c第7天58.54±7.21 36.67±8.43b 29.76±6.32c

2.2 Western blot检测大鼠海马区BDNF蛋白表达的结果NSCs移植组大鼠海马区BDNF蛋白表达量为（0.92±0.22），与模型组（0.86±0.25）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针+NSCs移植组大鼠海马区BDNF蛋白表达量为（1.45±0.35），明显高于NSCs移植组（0.92±0.22）、模型组（0.86±0.25），差异均有统计学意义（均P＜0.05）；表明电针+NSCs移植可增加大鼠海马区BDNF表达。见图1。

图1 大脑中动脉闭塞模型大鼠大脑海马区BDNF蛋白表达印记

3 讨 论

NSCs是一种具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞能力的细胞，主要发现于成年哺乳动物中枢神经系统的特定区域如海马齿状回室管膜下区（SGZ）和侧脑室颗粒下区（SVZ）［15］。相关研究已明确NSCs对细胞分化、免疫调节、炎症和内源性修复过程（例如血管生成和神经发生）的影响［16-18］。进一步，研究人员利用NSCs移植改善卒中模型鼠的缺损功能，发现NSCs移植后大鼠的运动功能、学习记忆能力有一定的提高，并探索了不同移植方式、移植位点对移植效果影响的问题［19-20］。在这些前期实验的基础上，2016年《柳叶刀》发表了1篇首次应用NSCs移植治疗脑卒中的1期临床研究文章，该研究采用手术方式将NSCs移植到11例脑梗死患者大脑病灶周边区域，结果表明NSCs移植没有诱发任何不良事件，且患者的神经功能得到改善，研究结果支持进一步应用NSCs移植治疗脑卒中［21］。我们在该实验中亦证实，与模型组大鼠相比，NSCs移植组大鼠在Morris水迷宫实验中逃避潜伏期时间缩短，表明NSCs移植组大鼠的空间学习记忆能力有所提高。综合相关研究结果表明，NSCs移植有望成为改善PSCI、治疗脑卒中的新技术。

但是，NSCs移植存在细胞存活率低，向损伤部位迁移和分化不足的问题。如将NSCs移植至脑梗死中心区，2周后几乎没有NSCs存活，将NSCs移植至脑梗死区周边区域时，其存活率仅为30%，且存在迁移和分化不足问题。这些因素限制了该技术的临床应用，因此，早期有研究指出如何促进NSCs移植细胞的存活、增殖、迁移和定向分化成为NSCs移植的关键［7-8］。

目前，NSCs的调控主要有2种思路，一种是增加NSCs自身的存活及增殖分化能力，主要通过基因修饰及药物预处理等，这样可以促进移植的NSCs在缺血、缺氧环境下的存活率［22］。另一种是改善脑缺血后的NSCs生存微环境（ME）［23］。所谓ME，在结构上，包括微血管、血管周细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、细胞外基质、神经前体细胞和小胶质细胞等，在功能上，包含这些细胞或成分所分泌的各种因子及与神经干/前体细胞之间的相互交融与作用［24］。脑缺血后，局部ME遭到破坏，如血脑屏障损害、微血管通透性改变、结构紊乱、基底膜降解及多因子表达异常等，限制了NSCs存活、增殖、迁移和分化［7］。前一种思路类似于改善NSCs的“种子”思路，后一种思路类似于改善NSCs的“土壤”。目前对2种思路均进行了大量有益的探索，但离突破性的进展尚远。我们的这项研究表明，电针可能具备改善NSCs的“土壤”作用。

电针是一种结合我国传统医学中经络学说和现代生物电理论的临床应用技术，既可以调节经气，疏通气血，又是一种脉冲电场，故具有针刺和电场的双重作用，目前已广泛应用于临床治疗脑血管疾病和科学研究。此前，我们通过激光共聚焦技术发现，电针能够促进MCAO大鼠海马区内源性NSCs的增殖和分化［9］。海马区与灵长类动物和啮齿类动物的学习和记忆功能密切相关，常被用来作为探究正常、病理情况模型研究，包括对学习记忆障碍的研究。脑缺血后会出现相应脑部萎缩、皮质变薄、神经元细胞发生病理性变化，当这些情况发生在海马等与学习记忆有关的脑区时，便会出现学习记忆障碍［25］。因此，我们此前的这项研究表明，电针可作为一种干细胞调控技术，通过诱导海马区内源性NSCs的增殖和分化从而改善认知功能。在本实验中，我们发现，与NSCs移植组及模型组相比，电针+NSCs移植组大鼠逃避潜伏期时间缩短，表明电针可进一步增强NSCs移植治疗PSCI的效果。此外，我们在该研究中发现，与NSCs移植组及模型组相比，电针+NSCs移植组大鼠海马区BDNF蛋白表达显著增多。由于BDNF是NSCs微环境中促进NSCs增殖和分化的关键因子，它通过与NSCs的酪氨酸受体激酶B（TrkB）结合促进NSCs增殖和分化。因此我们认为，电针可能基于调节海马区BDNF的表达调控外源性NSCs从而改善PSCI。

但是，限于本实验为初步实验，机制研究尚不深入，一方面并未对移植的NSCs进行标记示踪及进一步的增殖分化分析，尚不能回答电针调控移植的NSCs增殖分化程度以及迁移路径；另一方面，如前所述，NSCs的移植成功依赖于良好的干细胞生存微环境，这些微环境包括各种细胞和细胞外基质构成的结构以及相关细胞因子。本实验初步发现电针促进大鼠海马区微环境中BDNF表达，但是对于电针是否对NSCs微环境其他因子以及相关结构产生影响尚不清楚。

综上，结合相关研究及本实验结果，我们认为电针可能调节海马区BDNF的表达调控外源性NSCs从而改善PSCI。但限于初步探索，本实验的机制研究尚不深入。下一步，我们将采取NSCs示踪技术以及免疫荧光技术深入探讨电针如何调控移植的NSCs迁移以及增殖分化治疗PSCI，并全面评估电针对NSCs微环境因子以及结构的影响，并确定两者的关系，从而为治疗PSCI、促进脑卒中患者全面康复提供新的治疗技术和理论支持。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。