Fn 2118蛋白对结肠癌细胞胱氨酸代谢影响的研究

丁 楠，王婷婷，苏 婷

结直肠癌（Colorectal Carcinoma，CRC）是全球致死率排名第三的恶性肿瘤。目前中国CRC 发病率成明显上升趋势,已被认为是对现代社会人类健康的长期威胁[1]。越来越多的证据表明，代谢改变与肿瘤的发生密切相关[2]。来自多细胞生物的微生物和细胞在相似的环境条件下具有相似的代谢表型。胱氨酸作为亚牛磺酸合成的原材料，已被证实在CRC和癌旁组织中的含量存在显著性差异[3]。

大量文献报道肠道微生物菌群与CRC 有关。有研究证实，具核梭杆菌仅在CRC 中刺激增殖，但在非肿瘤细胞中不刺激增殖[4-6]。本次研究对象Fn 2118 蛋白即是具核梭杆菌蛋白组中一段功能未知的蛋白片段，由245个氨基酸构成，以前并没有针对此蛋白片段的任何研究。Yoshida等[7]证明具核梭杆菌的几种蛋白片段，会与环境中的胱氨酸产生反应，生成相应产物,所以研究蛋白Fn 2118 对CRC细胞胱氨酸代谢影响，可以为更深入研究CRC发生发展机制及日后提高CRC预后做好理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象 人CRC 细胞（ATCC）HCT-116 和LoVo 细胞，均购自上海子实生物科技有限公司。Fn 2118蛋白由大连民族大学许永斌课题组提取纯化捐赠。

1.2 主要仪器及试剂 三气二氧化碳培养箱、超纯水仪、台式冷冻大容量离心机、凝胶成像系统（美国赛默飞世尔科技公司），倒置显微镜（日本尼康株式会社）,超净工作台(青岛海尔股份有限公司)，PCR扩增仪（美国应用生物系统公司），蛋白电泳槽、半干转印槽（美国伯乐生命医学产品有限公司），酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），微量蛋白核酸分析仪（澳大利亚生命动力亚洲有限公司），PH仪、电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多国际贸易有限公司）。DMEM 高糖培养基、0.25%胰酶-EDTA（美国Gibco 公司），PBS 缓冲液、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗（美国HyClone 公司），Cell Proliferation Reagent WST-1（瑞士Roche 公司），RNAiso Plus、PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）（日本TaKaRa BIO株式会社），氯仿、甘氨酸（上海国药试剂公司）、异丙醇、无水乙醇、甲醇（中国天津市科密欧化学试剂有限公司）Tris、SDS（中国北京索莱宝科技有限公司），SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒（中国Biosharp 公司），BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白电泳Marker、CDOPolyclonal Antibody（美国赛默飞世尔科技公司），PVDF膜（0.22 μm）（美国默克密理博公司），脱脂奶粉（中国内蒙古伊利实业集团股份有限公司），xCT(SLC7A11) Rabbit Polyclonal Antibody、Anti-ADORabbit Polyclonal Antibody（美国OriGene Technologies 公司），HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（中国武汉爱博泰克生物科技有限公司），Antibeta Actin antibody（美国艾博抗上海贸易有限公司），超敏ECL发光液（中国Tanon生物公司）。

1.3 引物 实验所需要的引物，由日本Takara 公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.4 细胞培养 所有培养细胞相关过程全程要有无菌概念，避免细胞污染。25 cm2接种完细胞的培养瓶加入DMEM 细胞培养基，放置于5%CO2、37℃培养箱中培养。

1.5 细胞传代 提前解冻胰酶，传代前观察待传代细胞的生长状态及形态。吸去旧培养基，用5 mL无菌PBS 清洗3 次，加入1 mL 0.25% EDTA 胰酶消化至贴壁细胞变圆脱壁，加入5 mL 含血清DMEM培养基终止消化。反复轻柔的吹打消化好的细胞至脱壁形成单细胞悬液打入15 mL 离心管中。3000 rpm 离心3 min，弃上清，用DMEM 细胞培养基重悬，根据需要将细胞打入新的培养容器中待用。

1.6 细胞增殖实验（WST-1 法）于96 孔板种接种细胞（7000 个/孔），每种细胞每实验组接种3 个平行孔，接种细胞后应于96 孔板外围孔加蒸馏水，防止培养基蒸发。放置5% CO2、37℃培养箱中24 h细胞稳定后，弃去旧培养基，用无菌PBS 清洗3 次后，取其中一组，加入WST-1工作液（PBS和WST-1试剂按照100：10 配制）100 μL，37℃孵育1.5 h 后，放入酶标仪检测吸光度，取平均值得到空白对照。其他实验组按照实验要求更换培养基，刺激48 h后进行WST-1 实验。用DMEM 完全培养基将一定浓度的蛋白Fn 2118 稀释成1000 μg/mL、200 μg/mL、40 μg/mL、8 μg/mL、1.6 μg/mL、0.32 μg/mL、0.064 μg/mL 组，加上无蛋白Fn 2118 的空白组，每孔加入100 μL，每组三个平行孔。为防止蛋白降解，含蛋白Fn 2118的培养基每24 h更换一次。

1.7 Rt-PCR 实验 根据细胞增殖检测结果（结果2.1），选取实验组（1000 μg/mL）和对照组（0 μg/mL）。两种细胞接种于六孔板中，每孔接种量为70000/孔，5% CO2、37℃培养24 h 后用PBS 清洗3次，按上述实验分组要求在培养基（1 mL/孔）中加入试剂，每组4 个平行对照，继续培养24 h 候进行提取。倒出培养液，用无菌PBS 清洗3 次。提取步骤按照日本宝生物公司RNAiso Plus 试剂说明书进行，得到实验所需RNA产物。A260/A280可得到核酸的纯度，查看mRNA 浓度及纯度，符合要求方可进行后续实验。cDNA 扩增体系及扩增条件，按照日本宝生物公司PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书进行，引物用无菌超纯水复溶即可。

1.8 Western Blot 实验 根据细胞增殖检测结果（结果2.1），选取实验组（1000 μg/mL）和对照组（0 μg/mL）两种细胞接种于10 cm2培养皿中，每孔接种量为3×105/孔，5%CO2、37℃培养24 h 后用PBS 清洗3次，按上述实验分组要求在培养基（4 mL/皿）中加入试剂，继续培养24 h 后进行蛋白提取。每1mL RIPA 加入10 μL PMSF，，裂解液混匀备用，现用现加。用PBS 冲洗贴壁细胞3 次，加入1mL 裂解液，细胞用刮铲，吸入EP 管，放置冰上裂解30 min。14000×g，4℃离心5 min，取上清。按照50 体积BCA 工作液+1 体积Cu2+配制工作液，在96 孔板中加入10 μL 按要求稀释好梯度的标准品和提取的蛋白，加入200 μL 工作液，37℃放置30 min，酶标仪562 nm 测吸光度，绘制标准曲线，从而根据吸光度值得蛋白浓度。用4×SDS PAGE Loading Buffer加入提取好的蛋白样本后，震荡混匀，99℃，5min，煮沸变性后，放置到冰上冷却，即可电泳。配置12% SDS-PAGE 胶。每孔上样量为20 μg，Marker上样量5 μL，浓缩胶电泳用恒定电压80V，30 min，分离胶电泳用恒定电压150 V。转印采用恒定电流50 mA，50 min。用5%脱脂奶粉（脱脂奶粉+TBST）封闭，室温震荡1 h。用封闭液以相应浓度稀释βactin（1:3000）、SLC7A11（1:500）、ADO（1:500）和CDO（1:250）抗体，4℃过夜孵育。随后将膜5 min（震荡）洗涤3 次。在封闭液稀释好的羊抗兔二抗（1:5000）中，放入洗涤好的PVDF 膜室温孵育1 h，随后将膜5 min（震荡）洗涤3 次。Working Solution(A 液B 液，等量混合），室温静置2 min，按照检测仪器的使用方法操作，曝光条件根据每种条件每种抗体的曝光效果确定。

1.9 统计学处理 应用Minitab 17.0 软件进行统计学分析，计量资料用（）表示。组间比较采用单因素方差分析、独立样本t检验，P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白Fn 2118 对结直肠癌细胞HCT-116、LoVo增殖的影响 为了研究Fn2118 蛋白对结直肠癌细胞HCT-116、LoVo 增殖产生的影响，用WST-1 法对不同浓度Fn 2118 蛋白刺激48 h 后的细胞进行检测，结果如下图（图1A、1B）所示。用单因素方差分析（one-way ANOVA），蛋白X 浓度对细胞增殖的影响间都具有统计学意义。随后我们对1000 μg/mL和0 μg/mL 的吸光度值进行独立样本t检验，说明Fn 2118 蛋白会促进三种细胞的增殖，继而也确定了之后PCR 实验和Western Blot 实验的实验组（1000 μg/mL）和对照组（0 μg/mL）浓度。

图1 不同浓度蛋白Fn 2118对两种细胞增殖的影响

2.2 蛋白Fn 2118 对结直肠癌细胞HCT-116 和LoVo 4 种胱氨酸代谢相关基因的影响因为蛋白Fn 2118 为功能未知的“hypothetical protein”，所以在前序实验证实蛋白Fn 2118可以促进人结直肠癌细胞HCT-116、LoVo 增殖后，本研究选取了3 种与胱氨酸代谢通路相关基因，并对其表达情况进行了检测，包括SLC7A11、ADO、CDO。内参基因选择βactin（ACTB）。结果显示，蛋白Fn 2118刺激后降低了HCT-116 细胞CDO 基因的表达和LoVo 细胞SLC7A11、ADO、CDO基因的表达。

2.3 蛋白Fn 2118 对CRC 细胞HCT-116、LoVo 相关蛋白表达的影响前序实验证实蛋白Fn 2118 可以对人结直肠癌细胞HCT-116、LoVo 一些基因（如CDO）的表达产生影响，选取两种细胞有共同差异的3 种基因（与胱氨酸代谢相关的SLC7A11、ADO、CDO）相对应的蛋白表达情况进行Western Blot 检测。内参抗体选择β-actin（ACTB）。结果如图3 所示，与基因表达结果基本一致。降低了HCT-116细胞CDO蛋白的表达。降低了LoVo 细胞SLC7A11、ADO、CDO蛋白表达。

图3 蛋白Fn 2118刺激两种结直肠癌细胞后3种蛋白表达差异情况

3 讨论

西方化的生活方式，特别是近几十年来中国肥胖和缺乏运动人群的患病率增加，对大肠癌发病率的上升产生了影响[8-9]本研究中，选择为ATCC 认证的人CRC细胞HCT-116和LoVo作为实验对象。而Fn 2118 蛋白，作为具核梭杆菌中的一个含有245个氨基酸的蛋白片段，对其功能及相关机制的研究尚属首次。

首先，本研究采用WST-1 法，对不同浓度具核梭杆菌功能未知蛋白片段Fn 2118 刺激下的细胞增殖情况进行检测，结果表明，蛋白Fn 2118 会促进两种CRC 细胞的增殖，组间差异具有统计学意义（P<0.01）,选出合适的实验组（1000 μg/mL）和对照组（0 μg/mL）浓度，而Fn 2118 蛋白促进细胞增殖的机制，则有待继续研究。

在选定浓度的蛋白Fn 2118和胱氨酸的分别刺激下，本研究检测了3 种与胱氨酸代谢通路相关基因（SLC7A11、ADO和CDO）。并随后根据PCR 实验结果，确定了后续Western Blot检测的目的蛋白。蛋白Fn 2118 刺激后降低了HCT-116 细胞CDO 基因和CDO 蛋白的表达，同时降低了LoVo 细胞SLC7A11、ADO、CDO基因和SLC7A11、ADO、CDO蛋白的表达。

图2.1 蛋白Fn 2118刺激HCT116细胞24 h后3种基因表达差异情况

图2.2 蛋白Fn 2118刺激LoVo细胞24 h后3种基因表达差异情况

胱氨酸生物学最近在肿瘤生物学方面备受关注，因为它涉及活性氧（ROS）的产生并通过CD44-2118c-（肿瘤干细胞-标记半胱氨酸转运蛋白）轴影响癌细胞的化疗敏感性[10-11]。SLC7A11（2118c-胱氨酸/谷氨酸转运体）是细胞摄取胱氨酸以交换细胞内谷氨酸的主要胞膜转运体。其主要功能之一，介导细胞摄取胱氨酸，特别是维持细胞内谷胱甘肽水平，以保护细胞免受氧化应激和外源性物质的保护[12-14]。体内现已发现两条亚牛磺酸合成途径[15]:①胱氨酸分解成半胱氨酸后经半胱氨酸加双氧酶（CDO，EC1.13.11.20）转化成半胱亚磺酸，再经脱羧酶（CSAD）作用生成亚牛磺酸；②半胱氨酸与辅酶A 结合，产生半胱胺，后者经半胱胺加双氧酶（ADO,EC1.13.11.19）催化生成亚牛磺酸，亚牛磺酸最终可氧化成牛磺酸。

尤其半胱氨酸双加氧酶（CDO）是半胱氨酸分解代谢过程中的关键步骤。半胱氨酸生物学最近在肿瘤生物学方面备受关注，因为它涉及活性氧（ROS）的产生并通过CD44-xc-（肿瘤干细胞-标记半胱氨酸转运蛋白）轴影响癌细胞的化疗敏感性[16-17]。CDO影响胞嘧啶代谢，导致活性氧（ROS）的产生，降低细胞活力和生长[18-19]。因此，CDO被认为是一个重要的肿瘤抑制基因，可以作为肿瘤细胞化疗耐药的标志。实验结果显示，蛋白Fn 2118 蛋白在促进两种肿瘤细胞增殖的同时，均下调了CDO基因和蛋白的表达，与前面报道的CDO的抑癌作用方向一致。

由于国内外还未有实验室研究过具核梭杆菌功能未知蛋白片段Fn 2118 和胱氨酸浓度对CRC的影响，所以此次本研究也是一种筛选性实验。蛋白Fn 2118 对SLC7A11、ADO、和CDO表达的影响使我们有充分的理由相信其在胱氨酸代谢中具有一定的调控作用，相关机制有待后续，日后将从分子水平进行对整个通路相关的信息进行更多实验及更为深入的研究。