肺浸润性腺癌组织中miR-153-3p和PRDM2的表达

曲靓靓，朱丽娟，杨薇

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

肺浸润性腺癌是发生于肺泡上皮细胞的恶性肿瘤。病变的形成和进展与多种遗传物质及细胞因子的改变有关，其中包括多种DNA、RNA及蛋白等[1]。正性调控域锌指蛋白(PRDM2)是锌指蛋白家族中的成员，具有组蛋白甲基转移酶活性和抑制转录因子调控的功能。近年研究显示PRDM2在恶性肿瘤中的表达升高，是肿瘤形成的重要促进因子[2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年关注到的与多种肿瘤形成相关的基因，是19～25个核苷酸组成的非编码单链小RNA，通过与目标基因的3’UTR结合调节生物功能[3]。课题组前期进行生物信息学分析，选择与肺浸润性腺癌密切相关，且文献中尚未见报道的微小RNA-153-3p(miR-153-3p)进行研究，同时应用TargetScan数据库预测到PRDM2可能是miR-153-3p的靶因子。基于此，本实验进行实验设计，检测肺浸润性腺癌组织中miR-153-3p的表达，分析其临床及预后意义，探讨miR-153-3p与PRDM2的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2016年4月至2017年12月确诊为肺浸润性腺癌的患者56例作为研究对象。纳入标准：(1)患者均行手术治疗，术后均具有明确的病理诊断，符合WHO中的标准；(2)首次确诊；(3)临床、病理及随访资料齐全。排除标准：(1)诊断有异议者或病理诊断中伴有其它异源性成分者；(2)肺手术前患者行放、化疗者；(3)随访资料不全或家属不同意观察者。本组中男26例，女30例，年龄31～79岁，平均年龄(60.1±7.6)岁。其中有胸膜累犯15例，无胸膜累犯41例，肿瘤最大径0.9～6.7cm，平均(3.2±0.9)cm。选择肿瘤组织作为观察组，选择距肿瘤边缘>3 cm的正常肺组织作为对照组，均留取术后新鲜组织(-80 ℃冰箱冻存)及石蜡包埋组织。研究经医院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》中的相关要求，患者或家属已签知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 实时荧光定量PCR法检测miR-153-3p的表达

应用实时荧光定量PCR法(qRT-CPR)检测miR-153-3p的表达。基于新鲜组织进行实验，采用TRizol(美国Invitrogen公司)提取总RNA。引物由北京三博远志公司合成。miR-153-3p上游引物：5'-GTCAATTGAGCACGTGGCCAC-3'；下游引物：5'-GACGTACGGACTGACGGACCAC3'。以U6为内参，引物上游：5'-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3＇下游：5'-TTGGAATACGAATTGGCCG-3'。逆转录法合成cDNA(试剂盒为北京百奥莱博公司)。PCR反应的程序设定：95 ℃预变性30 s；变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，充分延伸72 ℃ 5 min。结果以2-ΔΔCt表示。PCR仪为美国伯乐公司生产。

1.2.2 免疫组化法检测PRDM2的表达

应用免疫组化SP法检测肺浸润性腺癌组织中PRDM2的表达。PRDM2为浓缩液，购自江苏睿赢生物技术公司，二抗和DAB购自北京中杉金桥生物技术公司。术后标本常规固定、脱水汲石蜡包埋后，切取4 μm切片。先按不同比例对PRDM2的浓缩液行预实验，选择预实验中PRDM2配比浓度为1∶120显色最理想的浓度用于正式实验。正式实验均由同一病理科技师操作，严格按说明书手工操作，一次性完成，DAB显色。PRDM2的阳性部位是细胞质和(或)细胞膜，选择5个400倍视野(热点区)进行观察，计算阳性率的平均值。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 两组中miR-153-3p表达的比较

两组中miR-153-3p的表达量差别有统计学意义，即观察组中miR-153-3p的表达量明显低于对照组(P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组中miR-153-3p的表达量的比较

图1 miR-153-3p表达(qRT-PCR法)

2.2 miR-153-3p在不同临床病理特征分组中表达的比较

MiR-153-3p在不同肿瘤最大径、肺膜累犯分组的表达中差异有统计学意义(P<0.05)。而在不同性别和年龄的分组中差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 miR-153-3p在不同临床病理特征分组中表达的比较

2.3 miR-153-3p 表达的生存分析

肺浸润性腺癌患者均进行术后3年(36个月)的随访，随访方式有电话随访、门诊随访及家访，截止时间点为2020年12月31日。其中存活26例，死亡27例，失访3例。死亡患者确诊后的生存时间为6～36个月，中位生存时间为22个月。以miR-153-3p表达的平均值(1.36)为临界值分组行K-M生存分析，结果显示miR-153-3p的表达与预后相关(χ2=5.67，P=0.036)，即miR-153-3p低表达患者的预后差，见图2。

图2 miR-153-3p表达的生存分析

2.4 观察组中miR-153-3p与PRDM2的相关性

TargetScan数据库检索显示miR-153-3p与PRDM2具有可能结合的位点，见表3。免疫组化方法检测到PRDM2的阳性率范围是10%～70%，平均为41.1%，见图3。相关分析显示miR-153-3p与PRDM2呈负相关性(r=-0.69，P=0.013)，见图4。

表3 TargetScan数据库检索显示miR-153-3p与PRDM2具有可能结合的位点

图3 PRDM2的表达(免疫组化SP法，200×)

图4 miR-153-3p与PRDM2的相关性

3 讨 论

肺腺癌是起源于肺上皮细胞形成的肿瘤，最肺组织中最常见的非小细胞癌，其发生机制复杂，其形成与多种分子生物学通路表达异常有关。PRDM2 是近年关注的与肿瘤形成相关的因子，也称为 Blimp2，主要通过募集转录共抑制因子进而调节靶基因的转录[4]。PRDM2最早期的研究认为PRDM2是调节机体免疫功能中B淋巴细胞向浆细胞分化的因子，进一步的研究发现，PRDM2可通过降低细胞的增殖和促进T细胞的凋亡，维持T细胞之间的平衡[5]。近年学者发现PRDM2可能具多种生物学作用，尤其是发现PRDM2可以调控肿瘤细胞增殖，并认为这可能是肺浸润性腺癌病变形成的经典途径[6-7]。研究显示PRDM2异常表达是肿瘤进展的重要调控因子，可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移有关[8]。PRDM2在恶性肿瘤的病变组织高表达，具有癌基因样的作用[9-10]。但是其起作用需要更多的介导因子。研究认为PRDM2的上游调控因子较多，包括miRNAs、长链非编码RNA、环状RNA及经典的蛋白调控通路[5]841-846。miRNAs的种类繁多。课题组在实验前进行筛查，选择出miR-153-3p进行实验研究，同时也发现miR-153-3p异常表达对肿瘤细胞增殖有一定的调节作用[11-12]。miR-153-3p在正常人体组织中具有稳定的表达状态，而在上皮源性恶性肿瘤中常伴有miR-153-3p表达的下调[13]。miR-153-3p在肿瘤中的作用可能与抑癌基因的作用相似，miR-153-3p 对下游多种因子的靶向作用可能是其调节肿瘤形成和进展的重要方式[14-15]。

本研究结果显示肺浸润性腺癌中miR-153-3p的表达下调，提示miR-153-3p低表达是肺腺癌形成的重要分子事件。miR-153-3p在肺腺癌形成过程中发挥抑癌基因样的作用。结果显示MiR-153-3p在不同肿瘤最大径、肺膜累犯分组的表达中差别有统计学意义，提示miR-153-3p 与肿瘤的生长及周围组织累犯相关，也提示miR-153-3p异常表达与肿瘤的生物学行为相关，miR-153-3p低表达时具有较高的侵袭潜能及生长潜能[16-18]。生存分析发现miR-153-3p的表达与预后有关，提示miR-153-3p可能对判断预后有一定价值，即miR-153-3p低表达的患者生存时间短，预后差。这种预后判断的具体价值需要后续临床进行多中心、大样本的研究来证实，并进一步确定其判断的临界值。生物信息学显示miR-153-3p和PRDM2具有结合的位点，相关分析显示两者具有负相关性，提示两者可能具有靶向调控作用。但是此种作用需要基础实验的双荧光素酶报告基因等实验来进一步证实。李冠军等[4]58-63通过在膀胱癌中研究，发现miR-153与PRDM2具有靶向作用，其能通过JAK/STAT信号通路影响膀胱癌的侵袭和迁移，此研究与研究的结论具有相似性。miR-153-3p异常表达可以活化PRDM2的表达，目前认为PRDM2在体内有2种启动子，外部启动子产物为PRDM2，但是当其甲基化后则影响后续的转录作用[8]2991-3002。PRDM2作为一种癌基因，可诱导肿瘤细胞增殖活性的改变，介导同质型粘附能力下降，细胞运动能力增强，侵袭和迁移能力增强[19]。Sun等[20]通过在胶质瘤中研究miR-153-3p的表达特征，发现miR-153-3p可能通过调控Bcl-2介导肿瘤的凋亡作用。miR-153-3p还可能通过对下游FOXO3等基因的靶向调控发挥作用[16]105126。因此miR-153-3p的作用方式及作用途径复杂，但是miR-153-3p调控的具体作用及在肺腺癌中的作用尚需要更多基础实验来进一步明确[21-22]。

综上所述，MiR-153-3p在肺浸润性腺癌中的表达下降，其与病变的形成和进展有关。MiR-153-3p与PRDM2可能具有协同负向作用。术后检测MiR-153-3p的表达可能对判断预后有一定作用。