层粘连蛋白及受体、IV型胶原在肺癌组织中的表达与肺癌的关系

王玉玲，张 杰

(首都医科大学附属北京天坛医院 呼吸与危重症医学科，北京 100070)

目前，全世界范围内因肿瘤而死亡的患者中，肺癌是重要的死亡原因之一。肺癌的预后差，五年生存率仅17%[1]。恶性肿瘤的预后及生存期与肿瘤细胞的分化、转移及侵袭能力密切相关[2]。层粘连蛋白(Laminin，LN)是细胞外基质中的重要组成成分，存在于各种动物体内的基底膜及多种肿瘤细胞的表面，与IV型胶原(type IV collagen,Col-IV)结合形成基底膜的骨架，对于细胞的生长、分化及运动具有调节作用[3]。大量研究发现，LN、Col-IV与恶性肿瘤细胞的浸润、转移及预后密切相关，在某些高侵袭性肿瘤组织中，LN及Col-IV的表达增加[2，4]，可诱导癌细胞表面更多的LN受体及Col-IV受体的表达，并分布于癌细胞的整个表面，使癌细胞更易与基底膜粘附，分泌多种蛋白溶解酶降解基底膜，穿透基质进入血液和淋巴管，从而导致血液及淋巴的转移。

67KD LN-R是发现最早、研究最多的层粘连蛋白受体，由一条多肽链组成，既能与LN结合，也能与细胞骨架成分特异性结合，实现肿瘤细胞与细胞外基质的粘附[5]；在人的多种肿瘤中，如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌等，癌细胞表面的LN受体密度与其侵袭性有关[6-7]。

本研究对肺癌患者血清、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、癌组织中LN及其受体、Col-IV的表达与肿瘤的病理类型、分期及转移的关系进行初步探讨。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选择首都医科大学附属北京天坛医院呼吸科2019年1月1日～12月31日确诊为肺癌的患者，完善腹部B超、头颅CT或核磁共振、骨扫描等检查判断临床分期及转移。收集肺癌组患者36例，男25例，女11例，年龄40～83(63.8±12.31)岁；其中肺癌组19例行支气管肺泡灌洗(BAL)和留取血清，ELISA法检测LN、Col-IV的含量；肺癌组另外17例因各种原因(如气管及左右主支气管肿瘤、患者一般情况差无法耐受，局部出血，或灌洗回收量少而弃去等)未能行BAL；选择同期住院的12例肺炎患者为对照组，亦行BAL和留取血清，男11例，女1例；年龄37～74(55.33±11.23)岁。肺癌组有32例病理标本行免疫组化检测LN及67KD LN-R，其中包括行BAL的15例，另有4例因病理标本太小未能行免疫组化检测。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

1.2.1.1 血清 肺癌组及对照组共31例患者于当日清晨BAL，空腹采静脉血5 mL，2 h内离心取上清液-80℃冰箱保存待检测。

1.2.1.2 BALF 完善操作前相关检查后，术中电子支气管镜远端楔入病变所在的支气管亚段，37℃无菌生理盐水100 mL，分次注入后立即以6.67～10.67 kPa(50～80 mmHg)的负压吸引回收液，经双层无菌纱布过滤，测量容量后离心，上清液-80℃保存备用。若灌洗液量<20 mL，则为无效灌洗，该患者剔除。留存标本同血清标本，采用ELISA试剂盒进行检测。

1.2.1.3 肺癌组织 采用首都医科大学附属北京天坛医院病理科2019年1月1日～12月31日根据病理学确诊为肺癌的存档蜡块的病理标本，用免疫组织化学SP法处理。

1.2.2 检测方法 血清及BALF 中的LN及 Col-IV的测定采用UNIONHONEST#ADL公司的人LN及Col-IV的ELISA试剂盒，按照操作步骤进行。

肺癌组织LN及67KD LN-R测定采用福州迈新生物技术公司的免疫组化试剂盒，阳性对照为福州迈新生物技术公司提供的阳性对照片。

2 结果

2.1 行BAL患者临床资料 研究组19例和对照组12例行BAL。肺癌组年龄40～77(61.84±11.25)岁，鳞癌9例(47.4%)，腺癌7例(36.8%)，小细胞肺癌2例(10.5%)，未分化癌1例(5.3%)。根据肺癌UICC/AJCC TNM分期及临床分期(2017年修订)为：临床1期5例，临床2期2例，临床3期7例，临床4期5例。

2.2 研究组和对照组BALF及血清中的LN、Col-IV比较 使用ELISA法检测BALF及血清中的LN、Col-IV，BALF数据使用白蛋白标化。结果显示，研究组患者血清中LN浓度与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；而研究组患者BALF中的LN浓度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。研究组患者血清和BALF中Col-IV浓度均较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)。两组LN在BALF中的浓度均较血清中升高，差异有统计学意义(P<0.01)；而两组Col-IV在血清中的浓度与BALF中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 研究组与对照组血清及BALF中LN、Col-IV浓度 ng/mL

2.3 免疫组化结果 行免疫组化患者32例，男24例，女8例，年龄40～83(61.7±11.8)岁。病理分型：鳞癌14例(43.8%)，腺癌10例(31.3%)，小细胞肺癌2例(6.3%)，未分化癌3例(9.3%)，腺样囊性癌3例(9.3%)。其中包括15例亦行BAL的患者。根据肺癌UICC/AJCC TNM分期及临床分期(2017年修订)为临床1期5例，临床2期2例，临床3期13例，临床4期9例。因腺样囊性癌常无远处转移，未纳入临床分期，予以剔除3例。

2.4 不同病理类型、临床分期和有无转移患者LN、67KD LN-R的表达比较 肺鳞癌病理类型LN及67KD LN-R的表达高于其他病理类型，差异有统计学意义(P<0.05)。早期和未转移患者LN的表达高于晚期和远处转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)；早晚期和有无转移患者在67KD LN-R的表达上差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。

表2 LN、67KD LN-R在肺癌患者中的表达

图1 LN、67KD LN-R在鳞癌中的表达

3 讨论

在本研究中，肺癌组BALF中LN浓度增高(P<0.01)，差异有统计学意义。肺癌组BALF的LN浓度高于血清，可能与肿瘤细胞分泌多种蛋白溶解酶溶解细胞外基质成分，如LN、Col-IV等，从而使LN在病灶处浓集有关。但LN在肺癌患者血清中浓度升高不明显，因此，采用BAL收集病灶处BALF检测LN对于我们早期诊断肺癌以及良恶性病变的鉴别诊断提供有用的证据，并对判断肿瘤的侵袭及转移情况具有提示意义。

Col-IV在肺癌组的血清和BALF中浓度均高于对照组，Mackay等研究已证实，Col-IV的过度表达与肿瘤的转移和侵袭密切相关[8]，肺癌患者血清中及病灶BALF中Col-IV升高，亦证实了这一观点。

本研究发现，肺癌组患者的血清和BALF中Col-IV浓度均较高，差异无统计学意义(P>0.05),对肺癌患者而言，该项的血清和BALF结果具有同等的临床意义。有研究认为，肿瘤患者Col-IV浓度的变化与化疗效果密切相关，化疗后Col-IV明显降低。因此，检测血清的Col-IV浓度即可反映病灶局部的肿瘤生长情况，无需再行BAL。

从免疫组化结果中可以看出，LN和67KD LN-R的表达与肺癌的不同病理类型有关，在肺鳞癌中，LN及受体明显表达，并可见两者联合表达，而在腺癌、未分化癌中的表达较少。

国内外大量的研究证实：在人的多种肿瘤中，如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等，癌细胞表面的LN受体密度与其侵袭性有关[7，9]。在肿瘤组织中，肿瘤细胞可产生LN，LN通过某种信号传导促进肿瘤细胞表面LN受体表达增加，两者相互作用增强肿瘤细胞与基质的粘附；同时，亦可促进肿瘤细胞Col-IV的表达增加，进一步增强与基质的粘附，多种途径影响肿瘤的浸润和转移。

以上研究均表明：LN与肿瘤的侵袭及转移密切相关，但我们在研究中观察到，LN并非在所有侵袭力强、转移早的肿瘤组织中表达，未分化肺癌、小细胞肺癌中的表达就很低，这提示着肿瘤的转移与侵袭并非LN这一条途径，可能存在多种因子、多种途径的参与，或者仅仅是侵袭与转移的其中一个步骤。也可能与本研究对这些类型的肺癌患者收集过少有关，需要进一步扩大样本来证实。

本研究发现，LN在临床早期和无远处转移的患者中表达增加，而在晚期及有远处转移的患者中表达减少。Moriya等在研究LN-5与小腺癌(<2 cm)关系时发现，LN的过度表达与小腺癌的淋巴结转移、血管的侵袭及病人的预后密切相关，并认为LN的过度表达是判断小腺癌，尤其是临床1期腺癌预后较差的一个指标[10]，与本研究结果一致。

Pesapane等研究发现，肿瘤细胞产生的LN本身与肿瘤的预后没有关系,但它却很大程度影响了67KD LN-R 判断预后的重要性[11]。肿瘤中LN及其受体均阳性表达的患者,预后很差,但67KD LN-R 阳性而LN表达阴性的患者其预后与67KD LN-R 阴性的患者无明显差异，说明了67KD LN-R 与其配体的相互作用对肿瘤的侵袭具有重要作用。但在本研究中却未发现67KD LN-R与肺癌的临床分期及转移密切相关，这与Givant-Horwitz等在67KD LN-R在卵巢癌中的表达研究结果较为一致[12]。

肿瘤的转移及侵袭过程非常复杂，是由多种途径、多种因子参与和相互作用而实现的，本研究仅仅初步探讨了LN及受体、Col-IV和原发性肺癌的关系，尚有许多机制有待于我们进一步研究。