超声辅助法提取黑豆中植酸工艺的研究

时宁宁 阮长青 李志江 张东杰

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室2，大庆 163319)(国家杂粮工程技术研究中心3，大庆 163319)(黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心4，大庆 163319)

植酸是由环己六醇与6个磷酸基团结合而成，在植物中以植酸盐形式存在，多数存在于种子中[1,2]。相关研究表明，植酸在一定程度上可以起到保护牙齿、预防肾结石以及防治糖尿病的效果，并且能够通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性[3,4]，广泛用于食品[5]、日化[6]、化工[7]等产业。在许多国家，谷物和豆类是微量元素重要的食物来源，豆类、玉米以及小麦和大米等植物籽粒大部分植酸分别存在于子叶、胚芽和糊粉层，普通的加工方式很难消除植酸带来的影响[8-10]。此外，由于人体和单胃动物胃肠道内无法降解植酸，植酸进入肠道后会与营养物质形成复合物，并会影响相关酶的活性，从而降低了营养物质的生物利用度[11,12]。

豆粕、麸皮、米糠等农副产品等常被用于动物饲料，相关研究也多数在于通过动物体重、氨基酸和磷利用率等方式，来探究植酸的抗营养作用及其降解方法[13,14]。但是关于粮食作物中植酸的提取、植酸与营养物质间的相互作用及其机理等相关研究相对较少。黑豆作为一种深色杂豆，具有良好的食用和药用价值，符合当前的消费观念，有关黑豆的加工产品如黑豆酱油、黑豆乳、黑豆纳豆等[15]。植酸的热稳定性较好，在生产黑豆相关制品时如黑豆粉、炒黑豆、黑豆乳等，无法对植酸进行有效的控制。因此，通过对黑豆中植酸的提取进行研究，充分提取黑豆中的植酸，提升植酸质量，是了解黑豆植酸含量、组成、相关特性以及提高黑豆营养价值的基础。

植酸的传统提取方法耗时长、提取率偏低，采用超声波辅助手段能显著缩短提取时间并提升植酸提取率[16]。超声波在传播过程中通过对溶剂的压缩和拉伸作用会形成空化泡，当空化泡破裂时产生极大的能量和负压，从而强化传质过程。同时，空化效应还伴随着一系列其他效果，如局部剪切力、侵蚀、破碎以及增强水合作用等，这些因素导致了溶液中整体反应的增强和固体颗粒表面积增大，使目标物质更易溶出[17,18]。因此，实验以黑豆为试材，以10%硫酸钠-盐酸作为浸提液，利用超声波辅助法对黑豆中的植酸进行提取，研究不同实验因素对植酸得率的影响，并通过响应面进行条件优化，以期最大程度提取黑豆中的植酸，可为植酸的纯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆(龙黑1号)，植酸(纯度99%)，甘氨酸，浓盐酸，三氯化铁，磺基水杨酸，无水硫酸钠。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-400KDE超声波清洗器，HZQ-c气浴恒温振荡器，TG16-WS高速离心机，723N可见分光光度计。

1.3 植酸的提取方法与条件优化

1.3.1 浸提法

根据文献[19,20]进行适当修改，通过正交实验设计得到酸浸法最佳提取工艺。称取黑豆粉2.000 0 g于锥形瓶中，按照料液比1∶16加入pH为2的10%硫酸钠-盐酸溶液，于60 ℃下振荡提取90 min，结束后于10 000 r/min离心10 min，将上清液移至50 mL容量瓶，定容备用。

1.3.2 超声波提取及单因素实验

超声波取的固定条件为：pH 2，温度60 ℃，料液比1∶14，超声时间20 min，超声功率200 W。在固定其他四个条件下分别考察pH(1、2、3、4、5)，温度(30、40、50、60、70 ℃)，料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)，超声时间(5、10、15、20、25 min)，超声功率(160、200、240、280、320 W)对植酸得率的影响。

1.3.3 响应面实验设计

在单因素实验结果的基础上，选择料液比、提取pH、超声温度、超声功率为实验因素，每个因素取3个水平，以植酸得率为指标进行Box-Behnken实验设计(表1)。

表1 响应面实验因素与水平表

1.4 植酸的测定方法

1.4.1 标准曲线的绘制

根据文献[21,22]进行适当修改，方法如下：分别取1 mg/mL植酸标准溶液0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mL于10 mL容量瓶中，使用甘氨酸-盐酸缓冲溶液(pH 2.4)定容，得到浓度为0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的植酸标准溶液，分别移取5 mL于离心管中，并添加3 mL显色剂(0.03%三氯化铁-0.3%磺基水杨酸水溶液)，摇匀后静置15 min，于8 000 r/min离心5 min，于498 nm处测上清液吸光度值，绘制出标准曲线。

1.4.2 植酸含量的测定

取0.2 mL提取液于15 mL离心管中，加入4.8 mL甘氨酸-盐酸缓冲溶液(pH 2.4)，以及3 mL显色剂，之后步骤同1.4.1，并通过植酸标准曲线计算出0.2 mL提取液中植酸含量。

(1)

式中：R为植酸的得率/mg/g；m为根据标准曲线计算得到的0.2 mL提取液中植酸的质量/mg；M为料质量/g。

1.5 数据处理及统计分析

所有实验结果均是3次平行实验得到的平均值，采用OriginPro 8.5绘制单因素实验的直观分析图，使用Design-expert 8.0.6统计软件对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

植酸标准曲线的方程为y=-2.672 8x+0.782 3，其中y为测定的吸光度值，x为所测溶液中的植酸含量，方程R2=0.999 6，说明所测溶液中植酸含量在0～0.3 mg范围内线性关系较好。

2.2 单因素实验

2.2.1 超声时间对黑豆中植酸提取的影响

由图1可知，在5～20 min范围内，植酸得率缓慢上升，20 min时植酸达到最大值。超声波能够加速溶剂渗入到原料内部，并且会增大溶剂的流动速度，辅以细胞内外物质的浓度差，使得植酸的提取速度加快[23]。持续延长超声时间，植酸从原料溶入溶剂中，植酸含量逐渐增大，当植酸的溶出达到平衡后，此时如果继续延长浸提时间，细胞破碎程度增大，游离出的部分植酸会与环境中的其他物质形成复合物从而使植酸含量呈现出小幅度的下降趋势[24,25]。因此选择超声20 min做为最佳提取时间。

2.2.2 溶液酸度对黑豆中植酸提取的影响

由图1可知，在超声波条件下浸提液的pH值对植酸得率的影响相对较大，随着pH的升高，植酸得率先上升后下降，在pH 2时达到最大。在低pH值的环境下植酸与阳离子之间的结合力减弱，植酸变成游离状态，但是如果pH过低，由于一些酸性多糖和蛋白的溶出量会增大，又会使游离植酸含量降低[26]。因此选择pH 2为最佳提取酸度。

2.2.3 超声温度对黑豆中植酸提取的影响

由图1可知，在30～60 ℃范围内，随着浸提温度的升高，植酸含量也在不断增大，在60 ℃时达到最大值，若继续增加温度，植酸得率开始下降。适当的升温有助于加快传质过程，使植酸更易溶出，但是温度过高会导致蒸汽压增大，更多的溶剂蒸汽进入气泡腔内，使空化泡的破裂强度较小，从而减弱超声效果[27]。另外，黑豆蛋白含量较高，而蛋白质在较高温度下会发生变性，从而聚集沉淀，包裹部分植酸存在于残渣中，从而使提取液中植酸的含量减少[28,29]。因此选择60 ℃最为最佳提取温度。

2.2.4 料液比对黑豆中植酸提取的影响

由图1可知，在料液比1∶8～1∶16的范围内，植酸得率随着料液比的增大先迅速增加，之后在1∶14时达到最大。随着料液比的增大，黑豆粉在溶剂中可以处于一种分散状态，更多的溶剂更有利于植酸的溶出，并且植酸的扩散速率也会随之增大，使植酸能够充分进入到溶剂中。而超声波所产生的各种效应可以使溶剂能更好地渗透到植物体内，从而提高溶剂渗透性，减少对所用溶剂的依赖。但是料液比过大，再加上超声波的作用，原料中的其他物质也会溶出，从而在一定程度上降低溶剂中的植酸含量[30]。因此选择1∶14作为提取的最佳料液比。

2.2.5 超声功率对黑豆植酸提取的影响

由图1可知，在超声功率160～240 W的范围内，植酸含量逐渐增大，在240 W时植酸得率达到最大值，此时继续增大超声功率，植酸得率则出现下降趋势。超声波的空化效应、机械效应、穿孔效应等共同作用使原料分子发生剧烈碰撞，细胞破裂，随着功率的增大，该作用不断增强，使得植酸得率随着功率的增加而增大，但是功率过大也会导致部分植酸降解为低级磷酸肌醇，以及增加杂质的含量，使植酸得率下降[31,32]。因此选择240 W为最佳超声提取功率。

图1 单因素实验结果

2.3 响应面优化实验

2.3.1 响应面结果与方差分析

根据Box-Behnken设计得到的方案与实验结果如表2所示，使用Design-expert8.0.6统计软件对实验结果进行回归拟合与显著性检验，得到方差分析表(表3)。

表2 响应面实验设计方案及结果

通过二次线性回归拟合，得到的关于植酸得率的回归方程为：Y=12.43-0.17A+0.052B+0.21C+0.005D+0.17AB-0.023AC+0.21AD-0.17BC-0.29BD-0.24CD-1.55A2-0.52B2-0.68C2-0.29D2

表3 响应面实验方差分析

2.3.2 响应面分析

响应面图的响应曲面表现了各因素对植酸得率的影响，曲面弧度越大表明此因素对植酸得率的影响越大，反之影响越小。等高线反映的是两两因素间交互作用的大小，等高线由圆形至椭圆形代表两因素间的交互作用由小至大。通过分析交互作用显著的响应面与等高线图，可知对植酸得率影响最大的是pH值，其次是料液比和温度，而超声功率的影响最小，响应曲面相对平缓。两两因素间的交互作用强弱顺序为：BD>CD>AD。

2.3.3 最佳工艺条件的确定

经响应面分析并结合回归方程得出黑豆中植酸的最佳提取工艺为：pH 2、温度60 ℃、料液比1∶14、超声功率236 W、时间20 min，植酸得率预测值为12.35 mg/g。根据实际情况，将提取工艺调整为：pH 2、温度60 ℃、料液比1∶14、超声功率240 W、时间20 min，在此条件下进行3次重复实验，植酸得率平均值为12.39 mg/g，与预测值误差较小。因此，该模型可用于黑豆植酸的提取工艺，具有实际意义。

2.4 超声波辅助提取与浸提法实验结果比较

由表4可知，超声波辅助法与浸提法相比，植酸得率提升了13.56%，并且减少了溶剂的使用，缩短了提取时间。

表4 超声辅助法与浸提法结果对比

3 讨论

超声波辅助提取在我国最早应用于中草药有效成分的提取，其主要特点是缩短提取时间、提高得率并且不破坏有效成分，目前已广泛应用于医药、食品、化工等行业。超声波所产生的空化效应、机械效应、毛细管效应等各种效应在整个提取过程中协同、反复作用使得整个提取过程速度加快，细胞破碎程度增大，因此具有缩短时间、减少溶剂用量、提高得率的特点[33-35]。有研究发现，植酸除了与金属阳离子结合形成植酸盐外，还会与蛋白质结合，储存在蛋白质储存液泡的膜结合腔室，其中含有植酸晶体和以溶解液泡为特征的蛋白质，而超声波可能会破坏腔室释放植酸，从而提升植酸得率[36]。

由实验结果可知，pH值和料液比对黑豆中植酸提取的影响较大，主要是因为植酸的螯合能力较强，较低pH下会与蛋白质形成二元复合物，而较高pH下会与金属和蛋白质形成三元复合物，因此在提取时应对溶液pH和料液比进行严格控制。通过与传统浸提法相比，超声波辅助提取用时少、溶剂用量少并且植酸得率升高，主要原因是超声波的空化效应及其产生的其他效应增大了传质速度，并在短时间内破坏原料结构，使溶剂更快的深入到细胞内，加快了植酸的溶出。

使用水浴形式进行超声波辅助提取时应注意的是，超声波的强度会因水浴、容器的形状和厚度等因素受到一定的影响，因此应选择平底、厚度较薄的容器，以减少超声波的衰减[34]。由于超声波在提取过程出会释放热量，功率越大对温度的影响越大，使得实际温度会超过设定温度。另外，超声波的频率越低其空化效应越强，理论上提取效果也越好，因此应该对较低或较高超声波功率以及超声频率对植酸提取的影响进行研究[18]。

4 结论

本研究建立了超声波辅助法提取黑豆中植酸的工艺条件，相对于传统提取方式减少了溶剂的使用量，并且很大程度上缩短了提取时间。实验以黑豆为原料，选择10%硫酸钠-盐酸作为浸提液，考察了pH、温度、料液比、时间、超声功率对黑豆中植酸提取的影响，并在此基础上进行响应面设计，获得最佳提取工艺为：pH 2、温度60 ℃、料液比1∶14、超声功率240 W、时间20 min, 在此条件下植酸得率为12.39 mg/g，相对于浸提法，超声波辅助法提取植酸得率提升了13.56%。