紧密连接蛋白在高尿酸血症致大鼠肾间质纤维化肾组织的表达及非布司他的干预作用

陈 敢 周姗姗 关昌杰 刘日光 秦曙光

广州市第一人民医院肾内科 (广州 510180)

慢性肾衰竭(CRF)是各种慢性肾脏疾病发展的最终阶段，肾小管间质纤维化在慢性肾脏疾病进展中起重要作用[1]。越来越多的研究表明[2]，导致肾脏纤维化的肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)伴随着上皮细胞间连接(tight junction)的破坏和失去粘附能力。尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，有研究表明，高尿酸通过影响肾小管上皮细胞功能紊乱从而导致高血压和肾间质损害，最终形成恶性循环导致肾功能衰竭[3]。草酸钙晶体液刺激MDCK细胞，引起MDCK细胞间质转分化，紧密连接蛋白表达及功能下调，其有增强肾间质小管损伤，提示紧密连接可能是草酸钙晶体液诱导肾间质EMT的启动环节[4]。而有关高尿酸血症诱导肾间质纤维化小管上皮细胞紧密连接蛋白表达关系的研究甚少。紧密连接蛋白中最重要的是跨膜蛋白occludin与胞质附着蛋白ZO家族及细胞内与其相连的细胞骨架蛋白，occludin与ZO-1的表达和分布与上皮细胞通透性密切相关[5]。故本实验我们利用高尿酸血症诱导大鼠肾间质纤维化模型观察高尿酸血症肾损害及肾间质纤维化发生、发展过程中，紧密连接蛋白occludin与ZO-1的表达变化以及它与高尿酸血症诱导肾间质纤维化间的关系，并应用降尿酸药物非布司他观察其对大鼠高尿酸血症所致紧密连接蛋白表达异常及与肾间质纤维化的关系。为寻找肾间质纤维化发生、发展中的治疗靶点，为CKD进行性发展的防治提供重要的理论依据和新的思路。

1 材料与方法

1.1 选用SPF级健康雄性SD大鼠30只(购自广东省实验动物中心),随机分为正常对照组—正常组；高尿酸血症模型组—模型组；非布司他干预组—干预组(n=10)。饲养于中山大学实验动物中心SPF级实验室，所有对大鼠操作均符合动物伦理委员会的要求。

1.2 主要试剂

非布司他(江苏万邦生物医药有限公司)，氧嗪酸、尿酸(购自美国Sigma化学公司)，Trizol总RNA抽提试剂盒、SYBR Green1染料(购自美国Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模：氧嗪酸(oxonic acid,OA)和非布司他配无菌蒸馏水溶解,尿酸用自来水溶解，均配置成所需浓度。模型组和干预组喂饲氧嗪酸,每日3次,同时给予尿酸水每日饮用[6]；干预组则于建立模型的同时给予非布司他灌胃,每日1次〔7〕；正常组给予等量的蒸馏水灌胃，自来水饮用，各组均连续给药6周。水合氯醛腹腔注射麻药，取各组大鼠肾脏组织，分别做免疫组化和荧光定量PCR。

1.3.2 肾脏组织学分析 将肾组织经10%的中性甲醛溶液中固定过夜，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片(4 μm厚度)后，进行马松三色(Masson)染色分析。

1.3.2.1 肾脏免疫组化 石蜡切片常规脱蜡水化后，3%H2O2室温孵育10 min，高压处理修复抗原，小牛血清封闭非特异性抗原，分别加入兔抗大鼠ZO-1、occludin多克隆抗体(美国Zymed 1:100)，4 ℃孵育过夜，显微镜下观察，苏木素衬染，脱水、封片。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 ZO-1、occludin mRNA表达水平，降Trizol试剂盒提取肾脏组织总mRNA，随后取3 mL RNA模板做逆转录反应，按实际说明书将RNA逆转录为cDNA,按SYBR Green 试剂盒说明书进行PCR扩增，引物序列见表1，以GAPDH作为内参使每个样品的目标基因标准化。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组生化指标的变化

第6周时模型组和干预组血尿酸均增高(均P<0.01)。血肌酐和血尿素氮在模型组和干预组高于正常组(均P<0.01)。而干预组较模型组低(P<0.05)；见表2。

表2 各组大鼠第6周血生化指标变化

2.2 肾脏组织Masson染色观察

比较三组大鼠肾脏组织RIF指数[8]，与正常组相比，模型组、干预组RIF指数均增高(均P<0.05)，干预组RIF指数低于模型组，高于正常组(均P<0.05)。见表3。

表3 三组大鼠6周时肾脏组织RIF指数

2.3 ZO-1、occludin免疫组化表达结果 与正常组相比，模型组、干预组ZO-1、occludin蛋白表达量显著减少(均P<0.05)，干预组ZO-1、occludin表达量高于模型组，低于正常组(均P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肾脏组织6周ZO-1、occludin蛋白表达光密度值(IOD)变化变化

2.4 ZO-1 、occludin mRNA的表达情况

实验6周时与正常组织比较，模型组ZO-1 mRNA表达是正常组的0.118倍(P<0.05)，干预组ZO-1 mRNA表达是正常组的0.510倍(P<0.05)；模型组occludin mRNA表达是正常组的0.128倍(P<0.05)，干预组occludin mRNA表达是正常组的0.385倍(P<0.05)。见表5、图1。

表5 各组大鼠肾脏组织6周ZO-1、occludin mRNA(相对定量数值(2—△△Ct))表达的变化

图1 ZO-1和occludin RT-PCR产物电泳

3 讨 论

跨膜蛋白occludin与胞质附着蛋白ZO-1是紧密连接蛋白中最重要的细胞骨架蛋白，在人体各组织器官中均有表达,目前研究表明，上皮细胞紧密连接蛋白参与机体多种生理过程，同时也参与了多种病理机制过程。许多肾脏病理状态下伴随着上皮细胞紧密连接蛋白结构和功能的改变，肾小管上皮细胞紧密连接的改变可影响肾小管上皮屏障功能并改变内环境稳态，从而启动慢性肾小管间质纤维化[9]，而高尿酸血症致慢性肾小管间质纤维化中对紧密连接蛋白影响的研究很少，本研究通过氧嗪酸联合尿酸方法复制大鼠高尿酸血症模型[7]，实验表现为血尿酸显著升高且肾功能显著下降。实验选取非布司他作为肾脏保护的阳性对照组。非布司他是近年来一种新型的降尿酸药物，它是非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以高度选择性的抑制黄嘌呤氧化酶，不受氧化或还原状态的影响，抑制尿酸的生成,延缓肾间质纤维化，延缓肾功能衰竭[10]。实验结果提示高尿酸血症成模后6周及非布司他干预组大鼠RIF指数明显增加,两组相比干预组较低(P<0.05)但高于正常组(P<0.05)，说明大鼠肾间质纤维化明显增加。模型组、干预组大鼠肾脏组织ZO-1 、occludin mRNA表达量较正常组明显降低(均P<0.01)，但干预组较模型组增高(P<0.05)，Peerapen P[4]等研究发现,在草酸钙晶体液刺激MDCK细胞，通过免疫荧光发现紧密连接蛋白表达量减少，Zeisber[11]等研究表明ZO-1在EMT过程中受到抑制，表达相应减少，而移植肾缺血再灌注之后，紧密连接蛋白ZO-1与粘附连接蛋白的表达均降低，在细胞内的分布发生改变[12]。这与我们的实验结果相一致，本实验发现ZO-1、occludin的表达与高尿酸血症引起的肾间质纤维化呈负相关(r=- 0.996,P<0.01)。由于ZO-1、occludin的表达减少时已出现肾间质纤维化，故紧密连接蛋白的表达减少是高尿酸血症肾间质纤维化的原因还是结果，尚无法定论。而本实验中应用非布司他干预血尿酸浓度，能显著改善ZO-1、occludin的表达，推测血尿酸浓度高低可能影响紧密连接蛋白的表达，至于是否通过其他因子影响紧密连接蛋白的表达尚有待进一步研究。同时我们发现，非布司他对大鼠肾功能的保护作用具有显著性意义。

由于肾间质纤维化早期阶段EMT是可逆的，所以尽早干预有可能诱导已发生的EMT的肾小管上皮细胞恢复正常，维持肾脏正常的组织结构和功能[13]。通过本研究，明确了高尿酸血症能下调ZO-1和occludin的表达，且低表达的ZO-1和occludin能有效促进肾小管上皮细胞发生EMT，这不仅加深了对EMT及高尿酸血症肾间质纤维化的认识，还提示增加ZO-1和occludin的表达和功能可作为一个新的高尿酸血症肾病治疗靶点。同时我们发现，在高尿酸血症大鼠肾间质纤维化发展过程中，随着大鼠肾间质EMT的发展，紧密连接蛋白的表达下调，非布司他具有减轻紧密连接蛋白表达下调的作用，说明非布司他对大鼠肾功能的保护作用具有显著性意义，为CKD进行性发展的防治提供重要试验依据和新的思路。