真空冷却鸡胸肉优势腐败菌生长模型的预测

莫 凡， 李 玲， 韩颖颖， 刘宝林*

（1.上海理工大学 能源与动力工程学院，上海 200093；2.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093）

鸡胸肉是世界上仅次于猪肉的第二大肉品[1]。具有高蛋白、低脂肪、低热量和低胆固醇的优点[2]，受到很多减肥人士青睐。常温下，刚屠宰的鸡胸肉内部的微生物会快速繁殖，使其腐败，故及时的降温处理十分必要。冷鲜鸡胸肉是指将宰杀后的鸡胴体经过冷却处理后，其胴体的温度在短时间内降至0~4℃范围内，并在后续加工、流通以及出售阶段一直维持此温度范围的生鲜肉[3]。在美国、法国等发达国家，冷鲜肉在肉类消费中占比很大[4]。冷却方法主要有风冷、水冷、碎冰和真空冷却。目前，我国对肉多采用风冷、水冷等方式，可这类传统方法费时费力，且不能保证鸡胸肉的卫生，易增加细菌的繁殖机会[5]。真空冷却是一种有别于传统冷却的迅速冷却法，具有速度快、均匀性较好、较卫生等优点。马志英等曾在熟肉制品研究中发现，真空冷却比自然冷却速度快了20倍以上，比鼓风冷却快了大约12倍[6]。在冷却后的鸡胸肉贮藏期间，优势腐败菌的增长与其肉类品质有很大关联性。因此研究优势腐败菌的生长模型非常重要。而传统的食品微生物学抽样检查法费时费力，结果滞后。预测微生物学可以通过鸡胸肉中优势腐败菌的生长模型，准确地判断鸡胸肉的变质情况，具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 鸡胸肉在冷藏期间的菌量、菌种测定

1.1.1 材料与设备 材料1：新鲜鸡胸肉及已被冷风冷却至5℃的鸡胸肉（上海圣华副食品有限公司产品），新鲜鸡胸肉买回后用真空冷却机快速冷却至中心为5℃，冷风冷却和真空冷却的鸡胸肉均切成6组（每组10 g），放入无菌托盘，置于5℃冰箱贮藏。

材料2：新鲜鸡胸肉500 g，真空冷却至中心为5℃。将其切成10 g的小块，放置无菌托盘上，用PE保鲜膜封口。分别保存在0、5、10、15、20、25℃，分别间隔4、6、8、12、24、48 h测定假单胞菌的菌落数量。

营养琼脂、营养肉汤、NaCl（分析纯）、无水乙醇：购自上海沃凯化学试剂有限公司；27F、1492R、E517F、E1063R、琼脂糖、EB染液、Loading Buffer、dNTP、Taq plus DNA Polymerase、Maker：购自生物工程上海股份有限公司；实验采用超纯水。

真空冷却机：上海理工大学自制；VD-850型超净工作台、THZ-103B摇床、RM1305069全自动高压灭菌锅、SCIENTZ-09无菌均质器：上海一恒科技有限公司产品；BIO-RAD电泳仪：北京六一生物科技有限公司产品；BCD-192KTJ（X）冰箱：青岛海尔有限公司产品；LHS-50恒温培养箱：上海精学科学仪器产品；TC1000-G PCR仪：Gene Company Limited基因有限公司产品。

1.1.2 实验方法 微生物培养技术[7]获得鸡胸肉表面的微生物；菌落巢式PCR-DGGE技术[8]分析微生物种类；当菌落总数、pH、TVB-N值中至少一个超过国标，所对应的值为假单胞菌的最小限量。

1.1.3 菌落总数测定 参照GB 4789.2—2016《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》[9]测定，重复3次。

假单胞菌菌落总数的测定：通过CFC假单胞菌选择性培养基结合GB 4789.2—2016《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》[9]测定，重复3次。

1.1.4 巢式PCR扩增和序列测序 采用巢式PCR的方法，使用细菌16SrDNA（通用引物），第一对引物采用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），巢式引物采用E517F（5′-GCCAGCAGCCGCGGTAA-3′）、E1063R（5′-CTCACGRCACGAGCTGACG-3′）进行扩增，PCR反应后的原液放在5℃冰箱中测序备用。

北京六合华大基因科技股份有限公司完成PCR原液的测序，测序后的拼接结果在NCBI上进行BLASRT相似序列检索比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov//Blast.cgi）。

1.1.5 pH值的测定 参照Arashisar等[10]的方法。称取10 g鸡胸肉放于无菌均质袋中，加入90 mL的蒸馏水，用均质器拍打1 min，静置约30 min后过滤，取50 mL的上层滤液用pH计测鸡胸肉的pH。

1.1.6 挥发性氨基氮（TVB-N）值的测定 取10 g对应的鸡胸肉，绞碎搅匀后分别置于不同的锥形瓶中，加入蒸馏水100 mL，振荡摇匀，浸泡30 min后过滤，滤液放置冰箱中备用。参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[11]测定，并且每种样品重复3次。

1.2 假单胞菌生长动力学模型的建立及拟合

1.2.1 真空冷却鸡胸肉中假单胞菌的生长动力模型 （一级模型） 一级模型采用经验修正的Gompertz模型[12-14]描述微生物数量与时间的关系，Gompertz模型方程式如下：

式中：N（t）为微生物在时间t时的对数值，（lg（CFU/g））；N0、Nmax为细胞浓度的初始值和最大值；μmax为时间t=M时的相对生长速率，h-1；M为达到相对最大生长速率所需要的时间，h。

1.2.2 二级模型的建立与验证 二级模型采用平方根模型，可以很好地预测出温度对假单胞菌最大比生长速率以及延滞期的影响[15]，常被用来描述温度对假单胞菌生长状况的影响[16]，公式如下：

式中：b为系数；μ为生长速率；λ为延滞期；Tmin为微生物的理论最低生长温度，℃；此时最大比生长速率为0。

偏 差 度 （bias factor，Bf）和 准 确 度（accuracy factor，Af）通常被用来评价模型的准确性[17-18]。当偏差度在0.75~1.25，准确度在1.1~1.9[19]时，一般认为这种模型可以被接受。

式中：N0为实验实际测得的微生物数量；N1为应用模型得到的与N0同一时间的微生物数量；n为实验次数。

2 结果与分析

2.1 菌相变化和菌种分析

2.1.1 不同冷却方式下菌落总数随冷藏时间的变化 我国对冷鲜肉的新鲜度无明确的标准，通常将菌落总数作为评价指标[20]。由表1知，在贮藏期间，真空冷却的鸡胸肉菌落总数明显少于冷风冷却，其中仅在第3天略高于冷风冷却。主要有两个原因，一是真空冷却过程中氧气分压降低，抑制严格需氧型微生物的生长和繁殖，如假单胞菌；二是真空冷却能杀死部分微生物如球菌和杆菌[21]。但是，两者菌落总数都随贮藏时间的延长呈上升趋势。参考相关研究[20]，冷鲜肉中细菌菌落总数应该低于6（lg（CFU/g））。冷风冷却的鸡胸肉在5℃条件下，前3 d可以维持较好的品质，而真空冷却的鸡胸肉在5 d以内都可以维持较好的品质。这为真空冷却延长冷鲜鸡胸肉的保质期提供了依据。

表1 不同冷却方式的鸡胸肉在不同贮藏时间内表面菌落总数变化Table 1 Changes of total number of colony on the surface of chicken breast prepared with different cooling methods during different storage time

2.1.2 菌种分析 基于PCR扩增产物的测序结果，分析冷风冷却和真空冷却鸡胸肉在不同冷藏期间内每种菌所占总菌数的百分比，结果见表2。经1~5 d贮存的两种鸡胸肉，通过表型（颜色、菌落）等观察，可以分为8类不同的菌种。其中，贮藏后期假单胞菌所占的比例最大，对其与相应理化指标做线性分析（见表3），可以看出，假单胞菌与各项指标都有较好的相关性，即假单胞菌是影响鸡胸肉的重要指标，且之前[22-24]的研究证明，假单胞菌是引起肉类变质的主要因素，即假单胞菌是鸡胸肉腐败的优势微生物。

表2 不同冷却方式的鸡胸肉在贮藏期间表面优势菌组成比例Table2 Proportion of dominant bacteria on thesurfaceof chicken breast meat with different cooling methodsduring storage

表3 鸡胸肉贮藏期间各项指标的皮尔逊相关系数Table 3 Pearson product-moment correlation coefficient of various indicators during chicken breasts storage

续表2

2.2 假单胞菌最小限量的确定

5℃贮藏期间真空冷却的鸡胸肉中微生物数量及其理化指标的变化见表1、表4。微生物的数量在第5天的时候变化较明显，由第4天的5.905（lg（CFU/g））增加到6.330（lg（CFU/g）），超过6（lg（CFU/g））。理化指标也发生了相应变化，TVB-N值从第3天的14.679 mg/hg增加到了23.300 mg/hg。结合假单胞菌数、TVB-N值、pH，参考国家标准[25]（TVB-N值＜15mg/hg），真空冷却鸡胸肉中假单胞菌的最小限量是5.373（lg（CFU/g））。

表4 真空冷却鸡胸肉的理化指标变化Table 4 Changes of indexes of vacuum-cooled chicken breast

2.3 模型拟合

2.3.1 一级模型的拟合 实验分别记录0、5、10、15、20、25℃贮藏期间鸡胸肉的假单胞菌总数，用Origin对鸡胸肉中的假单胞菌生长动力学模型（一级模型）方程拟合生长曲线见图1，模型方程见表5，动力学参数见表6。

表5 真空冷却鸡胸肉在不同温度下假单胞菌的生长动力学模型Table 5 Kinetic models for bacteria in chicken breast chilled by vacuum at different temperature

表6 不同温度冷藏鸡胸肉时假单胞菌的生长动力学参数Table 6 Kinetic parameters of Pseudomonas on vacuum-cooled chicken stored at different temperature

图1 不同温度下真空冷却鸡胸肉中假单胞菌的生长拟合曲线Fig.1 Growth data curves of Pseudomonas on vacuumcooled chicken stored at different temperature

2.3.2 温度对真空冷却鸡胸肉中假单胞菌生长参数的影响 图2、图3是用平方根模型描述的真空冷却鸡胸肉中温度与假单胞菌最大比生长速率、延滞期之间关系的模型。

图2 温度与最大比生长速率的关系Fig.2 Relationship between temperatureand themaximum specific growth rate

图3 温度与延滞期的关系Fig.3 Relationship between temperature and lag phase

结果显示，在0~25℃时，温度与假单胞菌的最大比生长速率以及延滞期有较好的线性关系。

2.3.3 真空冷却鸡胸肉中假单胞菌生长模型的验证、评价 根据鸡胸肉在10、15℃下假单胞菌总数的实际值和预测值（见图4），通过计算得出的偏差度和准确度见表7。在这两个温度下，平方根模型偏差度和准确度分别为0.75~25和1.1~1.9，由上述可知，1.2.2中的模型可被接受。且由图4可知，假单胞菌总数的实际值与生长模型拟合度较好，因此，该模型可以被用来预测微生物的生长趋势。

表7 真空冷却鸡胸肉在10、15℃冷藏期间微生物数量实际值与预测值的偏差度和准确度Table 7 Bias and accuracy of actual and predicted value of microorganism quantity in vacuum-cooled chicken breast meat stored at 10℃and 15℃

图4 假单胞菌总数实际值与预测值Fig.4 Sketch map of the total number of Pseudomonas measured and simulated

3 结 语

目前，微生物是导致肉类产品腐败的主要原因，找到其腐败期间的优势菌种并利用模型合理预测其在冷藏期间的生长趋势很有研究价值，可以较好地避免肉类变质而浪费的现象。本文中证明了与冷风冷却相比，真空冷却可以延长鸡肉的保质期。但是真空冷却的原理是利用水分的蒸发来吸收热量，故会引起鸡胸肉的干耗。但陈椒等[26]表明喷淋水分可以较好地解决这个问题，具体的实施方案还需谨慎设计。假单胞菌是鸡胸肉在贮藏期间的优势腐败菌，因此抑制假单胞菌生长繁殖是延长鸡胸肉保质期的方法之一，还可以计算鸡胸肉中腐败菌到达最小限量的时间来确定其保质期。