氨基甲酸乙酯降解酶的固定化研究

周雪燕， 石 淼， 康 宁， 王 壹， 王晓茜， 郭晓丰， 王 斌， 史学伟

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

固定化生物技术是使水溶性的细胞/酶与水不溶载体在物理或化学方法的作用下成为水不溶性细胞/酶的一类技术。酶固定化技术是用固体材料将游离的酶束缚或限制于一定区域，但仍具有催化活性并可重复使用的一种技术，其优点是：1）与游离酶相比，酶稳定性更高；2）可重复使用，节约资源；3）易于从目标物中实现分离；4）酶活性保留时间长；5）环保，对产物的影响较小。但也存在以下几点不足：对固定化技术要求高，增加成本；制备过程酶活受影响；固定化酶的效果受多种因素影响因而存在较大差异。

自1910年酶的固定化研究开始，酶的固定化技术也得到了很好的发展，尤其是酶的固定化新型载体层出不穷。人们常根据不同的应用需求选择不同的固定化载体，不仅要求它的固定化性能好，还有一些实际应用的要求[1-4]。比如食品领域就要求高安全性能、无污染性、经济实用性等。根据固定化载体的组成成分可将其基本分为以下3大类：无机载体（硅藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等[5-6]）、天然高分子材料（壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、纤维素等[7-8]）和合成有机材料（常见的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等[3，9-10]）。依据酶与载体的结合方式可将酶的固定化方法分为4类：吸附法是依靠带电的酶与载体之间的静电作用，使酶吸附于载体表面上的一种方法[11-12]。包埋法是将酶用物理的方法包埋在各种载体（网格或半透膜）内，此法是目前应用最多的一种理想的固定化方法[12]。交联法是借助双功能试剂使酶分子和载体之间发生交联的一种固定化方法，此法固定的酶具有良好的稳定性，常用的双功能试剂有戊二醛、甲醛、京尼平、双偶氮苯等[13]。共价偶联法是借助共价键将载体的功能基团（芳香氨基、羟基、羧甲基等）和酶的活性非必需侧链基团（羧基、巯基、羟基、酚羟基和咪唑基等）进行偶联的一种方法[14]。

在已有的报道中对固定化酶有如下研究：彭虹旎等以氨基多糖为材料，戊二醛为交联剂制备了表面光滑氨基多糖微球载体和多孔氨基多糖微球载体。以此载体对脲酶进行固定化，结果表明：多孔微球载体的固定化效率和固定化酶活力均高于表面光滑微球载体，因其固定的酶量更多，故表现出更高的酶活力[15]。2015年，王简之等使用磁性复合微球对脂肪酶进行固定化，得到的固定化脂肪酶在热稳定性、酸碱耐受性、重复使用率方面有所提升。在pH 4.0，共价固定6 h后，固定化脂肪酶的酶活损失低于40%[16]。有研究者将甲基丙烯、间苯二胺水凝胶、壳聚糖和氧化石墨烯反应制备复合材料，制得的复合凝胶在机械强度和吸附能力方面都有所提升[17]。

固定化酶在提高食品利用率和营养价值方面有突出贡献，比如固定化淀粉酶可以将淀粉分解为易被人体吸收的短链小分子糖[18-19]；固定化脂肪酶可用于代可可脂的脱脂；而研究较多的固定化脲酶已应用于酒精饮料中尿素和EC的去除，可以提升发酵饮品的饮用安全性[20-21]。为了充分发挥脲酶的实用价值，国内外研究者已对脲酶的固定化进行了不少探索[14，20，22]，而直到近几年，国内学者才逐渐展开对EC降解酶的固定化研究。赵雅敏对筛选到的产EC降解酶的菌株LBMAE-8进行研究，发现对该菌进行细胞固定化处理，壳聚糖/海藻酸钙微胶囊一步法比海藻酸钙包埋法制得的固定化细胞的酶活回收率高[23]。张迁等将来自P.rettgeri JN-B815的酸性脲酶经乙醇沉淀、离子交换等纯化后用壳聚糖微球进行固定化，制备的固定化酸性脲酶的温度稳定性、pH稳定性及对黄酒中尿素和EC的去除率均有所提升[24]。刘小锋使用氧化石墨烯（GO）和壳聚糖（CS）复合微球对酸性脲酶进行固定化，在流化床反应器中考察固定化酸性脲酶对黄酒的处理效果，该酶对黄酒中尿素的去除率高达93.85%，而对EC的去除率达到57.46%[25]。

固定化酶的酶活力、底物亲和力、米氏常数、反应活化能等性质会由于酶的性质、载体材料的性质及包埋条件的不同而发生改变，因此，一般对载体材料和固定化方法经过实验摸索才能确定最佳方案。通过筛选产EC降解酶的微生物并优化其产酶条件，从而获得一定数量的EC降解酶并将其应用于国内酒精饮料中EC含量的降低成为目前研究的一个热点。

作者围绕固定化EC降解酶的固定条件、酶学性质及应用展开研究，为保障发酵饮品的安全性提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取经活化和优化培养的CAT-4（Kluyveromyces marxianus）酵母菌株作为出发菌株，取其发酵液通过反复冻融结合超声破碎法得到EC降解酶粗酶液，待用。

乙醇（色谱纯）：天津致远公司产品；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司产品；其余溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DVB/CAR/PDMS（50/30μm）SPME萃 取 头、7890 B-5977 A气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司产品；FRESCO21高速冷冻离心机：Thermo Fisher Scientific公司产品；AS-4S超声细胞破碎仪：宁波新芝生物技术股份有限公司产品；722型可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 微球载体的制备及交联条件的优化

1）滴入法[26]制备壳聚糖微球 称取0.5 g壳聚糖溶解于50 mL体积分数1.0%的醋酸溶液中，置于摇床上活化2 h，将活化的壳聚糖用注射器逐滴加入含有质量分数20%NaOH和体积分数30%CH3OH的凝结液中，挑选出粒度均匀、形状规整的壳聚糖微球，用去离子水洗至中性，冷藏备用。

2）戊二醛交联壳聚糖载体的制备 将上述制备的微球置于体积分数6%戊二醛溶液中，在30℃恒温水浴锅中振荡6 h。反应完成后，用去离子水反复洗涤，以去除剩余的戊二醛，直至洗涤液在280 nm处的吸光度小于0.01，即得戊二醛交联壳聚糖微球载体。

3）粗酶液的制备及EC降解酶的固定化 取一定量戊二醛交联壳聚糖微球载体，加入适量CAT-4菌株产生的粗酶液，置于30℃恒温水浴摇床上振荡1 h。分离弃去上层溶液，用去离子水反复洗涤沉淀物，得到后续实验所用的固定化EC降解酶。

4）戊二醛体积分数对载体制备的影响 配制体积分数2%、3%、4%、5%、6%和7%的戊二醛溶液，用注射器将冷藏的壳聚糖微球缓慢滴加至不同体积分数的戊二醛溶液中，使其形成直径均匀的微球，在30℃恒温水浴锅中振荡6 h。反应结束后，用去离子水反复洗涤，直至洗涤液在280 nm处的吸光度小于0.01，即得戊二醛交联壳聚糖微球载体，置于4℃冰箱保存。用羟胺法[27]测其悬挂醛基质量分数。

5）戊二醛交联时间对载体制备的影响 用注射器将冷藏的壳聚糖微球缓慢滴加至体积分数为6%的戊二醛溶液中，使其形成形状规整、均匀的微球，在30℃恒温水浴锅中振荡2、4、6、8、10 h。其余操作同1.3.1中4）。

1.3.2 酶活力的测定 分别将1 mL粗酶液或1 g固定化EC降解酶和超纯水加到2支装有1 mL质量分数3%EC溶液的10 mL比色管中，将比色管置于37℃水浴锅中反应15 min后加入1 mL终止剂，充分混匀后依次加入各1 mL的显色剂I和显色剂II，强烈振荡后继续置于37℃水浴条件下保温20 min，用超纯水定容至刻度线，测定并记录A625nm值。酶活计算公式如下：

式中：M为酶活力；ΔA625nm为反应结束后空白对照与样品测定的光密度值之差；n为待测样液的稀释倍数；k为NH4+标准曲线中斜率的倒数[28]。

1.3.3 EC去除率的测定

1）相图的制作 参考文献[29]使用浊度滴定法测定双水相体系的二元曲线。具体做法如下：将乙醇逐滴加入盛有已知浓度K2HPO4溶液的玻璃容器中，直到在25℃时形成界限清晰的两相体系。记录此时乙醇和K2HPO4组成。在此基础上，将去离子水滴加到玻璃容器中，得到一个清晰的单相体系，继续滴加乙醇，再形成两相体系，如此反复。接着用不同质量浓度的K2HPO4重复上述步骤，记录数据。

2）乙醇和K2HPO4双水相体系（ATPS）提取“美乐”葡萄酒中EC 图1显示了用乙醇和K2HPO4双水相体系提取EC的原理。以含50μg/L EC和100 μg/L正丙基甲酸酯（PC）的体积分数55%乙醇溶液作为模型溶液，用酒石酸和NaOH调节pH并记录当前的pH。

图1 用ATPS提取“美乐”葡萄酒中EC的原理图Fig.1 Schematic diagram for extracting EC in‘Merlot’wine using ATPS

量取5 mL模型溶液和过量的K2HPO4固体加入离心管中，混匀后以4 000 r/min离心5 min，以确保两相完全分离。将离心管置于25℃恒温水浴中持续3.5 h达到相平衡。记录顶相体积并取1.5 mL的顶部溶液与150 mg无水硫酸镁完全混合，在转速为12 000 r/min的条件下离心1 min。最后，将1 mL上清液通过0.45μm膜过滤，用于GC-MS分析。

3）EC的GC-MS检测[30]使用Agilent 7890B GC-5977A MS系统进行EC的定量和定性分析。气相色谱柱为Carbowax 20M（30 m×0.25μm×0.25 mm），以氦气为载气，流量为1.0 mL/min，进样口温度200℃，检测器温度250℃。柱温采用程序升温：初始温度50℃保留1 min，以3℃/min升至180℃保留1min，然后以20℃/min升至220℃，保留10min。

质谱条件：以氦气为载气，采用电子轰击源（EI）的电离模式，电子能量70 eV；四级杆温度150℃；离子源温度230℃；选取离子监测（SIM）模式，选择质荷比（m/z）分别为62、74和89作EC的监测离子，m/z为62作定量离子；选择m/z分别为59、62和89来监测PC，m/z为62作定量离子。

1.3.4 挥发性风味物质的检测

1）香气化合物提取 根据顶空固相微萃取法（HS-SPME）改进的方法[31]提取挥发性风味化合物，并用GC/MS进行分析。将10 mL“美乐”葡萄酒样品和3.6 g NaCl放入15 mL萃取瓶中，再加入20μL 20 mg/L的3-辛醇标准溶液。萃取瓶用内衬密封，样品在45℃下平衡20 min，微萃取在45℃、500 r/min的搅拌下持续60 min。萃取结束将萃取头插入进样口解吸5 min。

2）色谱条件 用Agilent 7890 B气相色谱仪与5977 A质谱仪进行GC-MS分析。色谱柱型号HPInnowax column柱（60 m×2.5 mm×0.25μm），载气是流量为1 mL/min的氦气，进样口温度230℃。柱温采用程序升温：初始温度50℃保留5 min，以3℃/min升至125℃保留3 min，然后以2℃/min升至180℃保留3 min，最后以15℃/min升至230℃保留15 min。

质谱仪在电子轰击源（EI）的电离模式下运行，使用间隔为0.2 s的全扫描模式（扫描范围m/z 40~450），离子源温度200℃[32]。

定性和定量分析：通过将各组分峰中的化合物与NIST14.L谱库的标准化合物进行匹配，并将得到的质谱和保留指数（RI）与NIST14.L谱库中的标准化合物进行比较。用内标法计算各组分的相对含量[33]，结果表示为3个重复的“美乐”葡萄酒样品的平均值±标准差。

1.3.5 数据分析 每组实验重复3次，用Excel 2016对数据进行统计分析，结果表示为平均值±标准差（X±SD）。采用Origin Pro 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖载体交联条件的优化结果

2.1.1 交联剂体积分数对载体制备的影响 壳聚糖微球载体悬挂醛基的数量与其固定化酶能力的强弱有关。不同体积分数的戊二醛对壳聚糖微球载体上悬挂醛基质量分数的影响见图2。

图2 戊二醛溶液体积分数对悬挂醛基的影响Fig.2 Impact of glutaraldehyde concentration on the suspended aldehyde group

由图可知，在一定范围内，随着戊二醛溶液体积分数的增加，载体上的悬挂醛基质量分数呈上升趋势，但是当戊二醛溶液体积分数达到5%时，载体上悬挂醛基质量分数达2.4%，之后随戊二醛体积分数增加，载体上悬挂醛基反而趋于平稳。使用不同加酶量，测得数据与此一致。结果说明，体积分数5%的戊二醛溶液已经可以提供足够多数量的醛基与壳聚糖载体上的氨基发生交联反应，此时载体对酶的固定量达到最大[34]。因此载体制备时选用体积分数为5%的戊二醛溶液作交联剂即可。

2.1.2 交联时间对载体制备的影响 如图3所示，在2~8 h范围内，载体上的悬挂醛基随交联时间的增加而增加；当交联时间达到8 h后，悬挂醛基的质量分数基本保持不变。说明8 h的交联时间足以使戊二醛溶液中的醛基与载体上的氨基充分反应，使载体对酶的固定量最大。因此，选择8 h作为壳聚糖微球载体和戊二醛溶液的交联时间。

图3 交联时间对悬挂醛基的影响Fig.3 Impact of cross-linking time on the suspended aldehyde group

2.2 固定化EC降解酶的酶学性质

2.2.1 固定化EC降解酶的最佳反应温度及其稳定性 如图4所示，通过游离酶和固定化酶在30、36、42、48、54、60、66℃和72℃条件下的酶活结果可知，它们的最适温度分别为30℃和42℃。固定化酶在30~42℃酶活性逐渐增高，最适温度比游离酶略高；在42℃以后降解EC能力逐渐降低，与酶活呈下降趋势的游离酶变化基本一致；但固定化酶的酶活在42~72℃均高于游离酶。

图4 固定化EC降解酶的最适温度及其稳定性Fig.4 Optimal temperature and its stability of immobilized urethanase

出现最适温度转移可能是由于EC降解酶的空间结构受到固定化载体的影响而略有改变，尤其是在42℃以后，固定化EC降解酶的空间结构较为稳定，催化底物能力比游离酶略高。也有其他研究结果表明固定化脲酶与游离酶的最适催化温度有所差异[35-36]，但二者的催化效果并不存在显著差异。

稳定性结果显示，固定化EC降解酶在42℃条件下存放24 h后相对酶活仍能达到60%以上，说明固定化EC降解酶能够耐受一定范围的温度，对环境的适应性较好，在室温环境下无需低温保护，是一种环境友好型固定化酶。

2.2.2 固定化EC降解酶的最适pH及其稳定性从图5可以看出，在pH为3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5和4.8的条件下，游离酶和固定化酶催化底物EC的最适pH有所偏离，游离EC降解酶对pH 4.5的EC溶液具有最大的催化活性，且在pH 3.0~4.5酶活性逐渐增加，相对酶活在30%~100%之间；固定化EC降解酶的最适pH为3.6~3.9，且在此范围内酶活性均高于游离酶，尤其在pH 3.6左右表现出最大催化活性。

图5 固定化EC降解酶的最适p H及其稳定性Fig.5 Optimal pH and its stability of immobilized urethanase

稳定性结果显示，固定化酶在最适pH条件下反应时间越长，相对酶活性的下降速度越快，尤其是12~24 h期间的相对酶活变化率远远高于0~12 h的变化率。固定化酶在pH 3.6条件下放置24 h之后的酶活损失率不超过40%，说明固定化EC降解酶的耐酸性较游离酶好，更适于复杂环境的操作。之前就有研究将以京尼平为交联剂与来源于普罗维登斯菌（Providencia rettgeri JN-B815）的酸性脲酶进行交联，发现此交联酶能够适应黄酒的复杂微环境并去除尿素和EC[37]。2.2.3 固定化EC降解酶的乙醇耐受性 EC降解酶的乙醇耐受性在酒精饮料的应用中非常重要。从图6可以看出，随着乙醇体积分数的升高，游离酶和固定化EC降解酶酶活均随之下降，但固定化EC降解酶对乙醇表现出良好的耐受性。在乙醇体积分数为7%~25%时，固定化EC降解酶酶活均能保留50%以上，同游离酶的乙醇耐受性相比，变化有一定差异，初步推测此固定化方法对其乙醇耐受性和酶活提高有一定影响。说明此固定化EC降解酶与游离酶相比，在乙醇体积分数相对较低时可以保持相对较高的酶活[37]，适用于乙醇体积分数相对较低的发酵酒精饮料。

图6 乙醇对固定化EC降解酶酶活的影响Fig.6 Effect of ethanol on urethanase enzymatic activity

2.2.4 固定化EC降解酶的重复使用性 如图7所示，在模拟酒样对固定化EC降解酶进行重复性实验，结果显示，每次使用后酶活均有下降。当重复使用8次以后，固定化EC降解酶酶活力保留在50%以上，因此在8次前使用效果较好。

图7 固定化EC降解酶的重复使用次数Fig.7 Reusability of immobilized urethanase

此结果与文献报道的GO-CS复合固定酸性酶使用10次时的酶活80%相比，可使用次数稍显劣势[25]，但就所得固定化酶而言，仍然可以考虑将使用次数尽量控制在8次以内以获得更好的效果。

2.2.5 固定化EC降解酶的储存稳定性 固定化EC降解酶在不同储存温度随贮藏时间的酶活变化如图8所示。在4℃条件下，酶活随时间逐渐降低，酶活降低速率在1~3周和4~6周的变化都较平稳，而在3~4周的变化最大；且贮藏6周之内，酶活损失不足30%。在20℃条件下，酶活随时间延长逐渐降低，至第5周时基本保持不变，但在贮藏6周之后，酶活仅达到60%。说明贮藏温度对固定化EC降解酶的酶活有一定影响，但不是唯一因素。因此在该实验条件下，尽量将固定化酶保藏在4~20℃，但基于固定化酶最适反应温度和出于经济节约方面的考虑，以20℃作为最佳贮藏温度条件。

图8 固定化EC降解酶储存稳定性Fig.8 Storage stability of immobilized urethanase

2.3 固定化酶对“美乐”葡萄酒的影响

2.3.1 固定化酶在“美乐”葡萄酒中的稳定性 如图9所示，随着静置时间增加，游离酶和固定化EC降解酶酶活均呈现下降趋势，但在整个过程中，固定化酶酶活均高于游离酶酶活。当静置96 h时，固定化酶酶活与游离酶酶活相差最大，相较于起初酶活差异，后期的差异更大，可能是由于相同酶量的条件下，起初游离酶更容易与底物接触，而随着时间推移，固定化酶由于载体的保护作用，仍能慢慢显示出较高的酶活性。静置144 h之前，固定化酶酶活的损失率在50%以下，说明此酶可以适应“美乐”葡萄酒的微环境，用于葡萄酒中EC的去除。

图9 “美乐”葡萄酒中固定化EC降解酶酶活的变化Fig.9 Changes of immobilized urethanase activity in‘Merlot’wine

2.3.2 固定化酶对“美乐”葡萄酒中EC的去除率“美乐”葡萄酒样品中添加等量酶活的固定化EC降解酶和游离酶一段时间后，样品中EC质量浓度逐渐降低。

从图10可以看出，样品中加酶处理后，处理组的EC质量浓度均低于对照组，处理组的EC去除率高于对照组，说明无论是游离还是固定化EC降解酶的处理，均使“美乐”葡萄酒中EC质量浓度得到了降低，但游离酶酶法去除EC的效果要优于固定化酶处理法。在该实验条件下，固定化EC降解酶对“美乐”葡萄酒中EC的去除率可达30.90%，是游离酶的81.53%。

图10 游离和固定化EC降解酶去除EC的效果Fig.10 Influence of free and immobilized urethanase on EC

2.3.3 固定化酶对“美乐”葡萄酒挥发性物质的影响 葡萄酒的风味不是独立存在的，而是由醇、酯、酸、醛、酮、萜类化合物和C13-萜烯类化合物相互协调而产生的，它们共同构成了葡萄酒香气的组成成分[38]。对“美乐”葡萄酒中香气化合物及其相对含量进行了定性和定量分析。

对照组和处理组的葡萄酒中挥发性风味物质的相对含量如表1所示，在3种处理方式下的葡萄酒中，共检测到29种香气成分，包括12种酯类、9种醇类、3种有机酸和5种醛、酮、酚类。经分析可知，不同处理组中各挥发性物质的相对含量之间无显著差异，但是相较于对照组，处理组的物质种类均有所减少，其中固定化酶处理组减少了8种物质，而游离酶处理组减少了12种物质。说明酶处理对葡萄酒中挥发性物质的种类数量有些许影响，但对化合物的相对含量影响不显著，而且，固定化酶处理方式对葡萄酒更加友好。相比对照组，酶处理组中的物质均出现了数量的减少，但消失的物质并不相同，固定化酶处理组减少的物质包括：香茅醇、正癸醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和异丙醇。而游离酶处理组减少的物质分别是香茅醇、β-大马士酮、糠醛、正癸醛、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、2，3-丁二醇、异丙醇、1-己醇。说明不同类型的酶处理对葡萄酒的影响不同，但考虑到游离酶引起芳香味和果香味物质的损失更大，由于在考虑风味复杂性时要避免不愉快风味的发展，因此建议对“美乐”葡萄酒使用固定化EC降解酶进行处理。

此外，不同处理组测得的挥发性风味化合物的组成也有明显不同。表1和图11显示了“美乐”葡萄酒中不同酶处理方式下主要挥发性香气成分（醇、酯类、酸和醛）的变化规律。

图11 “美乐”葡萄酒中挥发性风味化合物的成分组成Fig.11 Composition of volatile flavor compounds in‘Merlot’wine

表1 不同酶处理方式对“美乐”葡萄酒中挥发性化合物的影响Table 1 Effects of different enzyme treatment on volatile compounds in‘Merlot’wine

由C6化合物、挥发性酚类物质和苯类化合物组成的香气成分在“美乐”葡萄酒中随着酶处理方式的不同而呈现出不同的趋势。酶处理后醇类和醛类占比降低，而酯类和酸类均有所增加，其他类基本保持不变，表明不同的酶处理方式对挥发性香气化合物产生了一定影响。尽管酶处理方式对葡萄酒中挥发性物质的相对含量没有显著影响，但引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变，且游离酶对其不利影响要大于固定化酶。因此，在人们接受风味有所改变的前提下，固定化EC降解酶更适合用于“美乐”葡萄酒。

续表1

3 结语

通过对壳聚糖与戊二醛的交联条件进行优化后发现，以体积分数5%的戊二醛溶液作交联剂，交联反应进行8 h时，载体对酶的固定量达到最大。之后对EC降解酶的酶学性质展开分析，得到如下结果：固定化EC降解酶的最适温度是42℃，在此温度下放置24 h时相对酶活达60%以上；其最适pH是3.6，在此条件下放置24 h的相对酶活大于60%；在体积分数7%~25%乙醇下，酶活均保持在50%以上，说明该固定化酶的乙醇耐受范围广，催化活性高；该酶在重复使用8次后，酶活还保持在50%以上，而且分别在4℃和20℃下贮藏6周后的酶活损失率不足30%和40%。最后，采用ATPS结合GC-MS检测不同酶处理的“美乐”葡萄酒中含有的EC，得知固定化EC降解酶的EC去除率达30.90%，是游离酶的81.53%。EC降解酶的处理方式对葡萄酒中挥发性物质的相对含量没有显著影响，只是引起了香气物质种类的减少和香气成分的改变，但固定化酶对挥发性风味物质的不利影响远低于游离酶。