苹果酵素复合型羊乳的制备及抗氧化活性研究

张艾青

（山东畜牧兽医职业学院 食品与药品科技学院，山东 潍坊 261061）

羊乳具有特殊的风味、营养价值及保健功能，但由于其自带的膻味较重，极大程度限制了羊乳制品的研究与生产加工[1]。羊乳中蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素及多种生物活性物质的含量较高，主要营养物质含量与母乳较相近，且具有抗过敏、抗衰老、提高免疫力等保健作用[2]。经调查研究发现，乳酸菌发酵羊乳可以减轻羊奶特有的膻味，提高羊乳产品的营养物质含量，同时发酵能提高羊乳的抗氧化能力。有研究表明，山羊乳经乳酸菌发酵后有较强的抗氧化能力，主要体现为DPPH自由基清除能力和抑制脂质过氧化能力的增强[3]。根据国内外研究表明，发酵剂的复合使用可以有效弥补单一发酵剂发酵的缺点，使发酵乳制品的口感、风味较单一发酵剂发酵乳制品更容易被广大消费者接受[4]。

酵素是以水果、蔬菜、食用中药材等为原料，通过天然发酵或添加有益微生物发酵而成的一类具有保健功能的发酵制品[5]。酵素中不仅含大量的氨基酸、矿物质、功效酶等发酵原料中原有的成分，也具有较高含量的还原糖、维生素C、酚类、花色苷、超氧化物歧化酶等抗氧化物质[6]，具有清除人体自由基、美容养颜等多种益生作用[7-8]。目前天然酵素的开发和利用还处于初级水平，有待进一步深入[4]。苹果酵素是以苹果为原料，经自然发酵所得，其含有大量的维生素、矿物质、酵母菌及其代谢产物等，具有一定的生物功能[9]。经研究表明，发酵所得的苹果酵素具有较强的抗氧化能力，强于苹果的抗氧化性[10]。而用苹果酵素发酵羊乳的研究至今未有报道。

作者以苹果酵素协同多菌种（丁二酮乳酸链球菌与双歧杆菌）制备发酵羊乳制品，并测定其抗氧化活性。将苹果酵素添加至羊乳制品制成苹果酵素发酵羊乳产品，不仅增加其抗氧化性，还有效提高了产品的适口性，更易被消费者接受，促进水果酵素发酵羊乳产品的商业化应用，为后续羊乳制品的生产和开发提供一定的技术支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：新鲜羊乳由山东阳春羊奶乳业公司提供，苹果为山东潍坊红富士。

A发酵剂（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌质量比为1∶1）、B发酵剂（丁二酮乳酸链球菌∶双歧杆菌质量比为1∶1）：购于丹麦Danisco公司；浓硫酸、无水硫酸铜、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠、甲醛等均为分析级：购于天津市大茂化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：赛多斯科学仪器有限公司产品；精密数显酸度计：上海电子仪器厂产品；HH-4电子恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司产品；离心机：上海安亭科学仪器厂产品；分光光度计：常州澳华仪器有限公司产品；SQ510C立式压力蒸汽灭菌锅：重庆雅马拓科技有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 苹果酵素制备 将苹果洗净、晾干后分别切块，按照白砂糖、水果和蒸馏水质量比为1∶8∶10加到发酵罐中，把罐体密封好置于25~30℃发酵，每隔3 d于无菌操作台中通气1次，静置发酵30 d。在无菌状态下，6℃、4 000 r/min离心10 min，保留上清液，保存备用[11]。

1.3.2 苹果酵素发酵羊乳制备 新鲜羊乳添加质量分数6%的蔗糖，20~25 MPa均质处理后90℃杀菌30 min，冷却至40~45℃，添加质量分数1%~5%的苹果酵素，装瓶后在41~44℃下培养2.5~4.0 h，置于0~4℃储藏。

1.3.3 发酵羊乳制备 新鲜羊乳添加质量分数6%的蔗糖，20~25 MPa均质处理后90℃杀菌30 min，冷却至40~45℃，添加质量分数3%的双歧杆菌，装瓶置于41~44℃，培养时间2.5~4.0 h，将发酵好的羊乳置于0~4℃储藏。

1.3.4 复合发酵剂发酵羊乳制备 新鲜羊乳添加质量分数6%的蔗糖，20~25 MPa均质处理后90℃杀菌30 min，冷却至40~45℃，添加质量分数3%的发酵剂（发酵剂A或发酵剂B），装瓶后在41~44℃下培养2.5~4.0 h，将发酵好的羊乳置于0~4℃储藏。

1.3.5 复合型发酵羊乳制备 新鲜羊乳添加质量分数6%的蔗糖，20~25 MPa均质处理后90℃杀菌30 min，冷却至40~45℃，添加苹果酵素和发酵剂，41~44℃下装瓶，培养2.5~4.0 h，将发酵好的复合型发酵羊乳置于0~4℃储藏。

1.3.6 发酵羊乳感官评定 发酵羊乳感官评定指标按照GB 19302—2010[12]进行评定，具体指标见表1。

表1 感官评价指标Table 1 Sensory evaluation index

1.3.7 发酵羊乳理化指标测定 蛋白质检测按照GB 5009.5—2016方法测定，脂肪含量按照GB 5413.3—2010盖勃法测定，非脂乳固体检测按照GB 5413.39—2010方法进行测定[13-15]。

1.3.8 乳酸菌数测定 按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验方法》测定发酵羊乳中乳酸菌数[16]。

1.3.9 DPPH·自由基清除能力的测定 参照文献[17-20]的方法，将400μL提取液与2.6 mL浓度0.1 mmol/L的DPPH（用乙醇溶解）溶液混合，在黑暗中放置30 min，使用无水乙醇作为空白，并测量517 nm处的吸光度。DPPH的清除率计算公式如下。

式中：D为DPPH清除率，%；A1为样品与DPPH溶液的吸光度；A2为样品与无水乙醇溶液的吸光度；A3为无水乙醇与DPPH溶液的吸光度。

1.4 数据处理和分析

采用Excel 2007和Origin 8.0软件进行数据处理和绘制曲线图，SPSS 17.0进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苹果酵素添加质量分数对发酵羊乳感官评定指标的影响

由表2可以得出，苹果酵素添加的质量分数越高，发酵羊乳的凝固性越强，苹果口味越强，酸度和甜度呈现增加趋势。当苹果酵素添加质量分数为4%时，发酵羊乳凝固性好，色泽为乳白色，颜色分布均匀，具有发酵羊乳特有的风味，有苹果口味，酸度合适，甜度合适，口感较佳，易于被大众接受。其可能原因为，苹果酵素添加质量分数过低，发酵能力不够，出现了发酵不完全，产品酸度低，凝固性差，甜度低等现象。

表2 苹果酵素发酵羊乳感官评定Table 2 Sensory evaluation of goat milk fermented by apple-ferment

2.2苹果酵素添加质量分数对发酵羊乳理化指标的影响

由图1（a）可知，当苹果酵素添加质量分数增加时，发酵羊乳中脂肪和蛋白质含量均降低，且存在显著性差异（P<0.05）。由图1（b）可知，随着苹果酵素添加质量分数增加，发酵羊乳中非脂乳固体含量呈上升趋势，且存在显著性差异（P<0.05）。原因在于苹果酵素中含有大量蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，可以酶解羊乳中的蛋白质和脂肪，从而使发酵羊乳中的蛋白质和脂肪含量降低[21]，故当添加苹果酵素时，苹果酵素发酵羊乳中蛋白质和脂肪含量降低。综合口感和营养成分考虑，苹果酵素添加质量分数为4%时最佳。

图1 苹果酵素添加质量分数对发酵羊乳理化指标的影响Fig.1 Effect of apple-ferment addition on the physicochemical properties of fermented goat milk

2.3 不同发酵剂对发酵羊乳感官评定指标的影响

从表3可知，A发酵剂和B发酵剂发酵羊乳的凝固性、色泽、滋味和气味等感官评价结果相似，但B发酵剂酸度明显优于A发酵剂。保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、丁二酮乳酸链球菌和双歧杆菌是发酵酸奶常用的发酵剂，发酵能力基本相同，可使发酵所得的羊乳具有酸奶特有的口感、风味[22]。丁二酮乳酸链球菌发酵羊乳可以产生特有的酸乳风味，因其可以发酵柠檬酸，产生具有芳香气味的丁二酮[23-24]。利用单一的双歧杆菌发酵羊乳作为阳性对照，对比发现B发酵剂发酵羊乳酸度合适，风味俱佳，故而B发酵剂较佳。

表3 发酵剂发酵羊乳的感官评定Table 3 Sensory evaluation of goat milk fermented by starter cultures

2.4 不同发酵剂对发酵羊乳理化指标的影响

由表4可知，相较于A发酵剂发酵羊乳，B发酵剂发酵羊乳脂肪和非脂乳固体质量分数分别增加0.63%和0.07%，但差异性不显著（P>0.05），蛋白质质量分数增加7.43%，存在显著性差异（P<0.05）。相较于双歧杆菌发酵羊乳，B发酵剂发酵羊乳蛋白质、脂肪和非脂乳固体质量分数分别增加11.33%、2.75%和0.36%，存在显著性差异（P<0.05）。双歧杆菌可以产生人体必需的B族维生素、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等营养物质[25]。

2.5 不同发酵剂对发酵羊乳中乳酸菌数的影响

到发酵终点时，测定发酵羊乳中的乳酸菌总数。由表4可知，A发酵剂发酵羊乳乳酸菌数为3.8×106CFU/mL，双歧杆菌发酵羊乳乳酸菌数为3.2×106CFU/mL，B发酵剂发酵羊乳乳酸菌数为4.5×106CFU/mL，明显优于A发酵剂。乳酸菌可提高人体对发酵羊乳中乳糖、钙、磷、铁的利用率，促进维生素D的吸收和增加蛋白酶的分泌，使发酵羊乳中的蛋白质更易于消化吸收[23]。综合2.3和2.4的结论，选择B发酵剂应用于制备发酵羊乳。

表4 不同发酵剂对发酵羊乳理化指标的影响Table 4 Effects of different starter cultures on the physicochemical indexes of fermented goat milk

2.6 发酵剂添加质量分数对复合型发酵羊乳感官评定指标的影响

苹果酵素复合B发酵剂发酵羊乳感官评定指标见表5。当B发酵剂添加质量分数为2%~3%时，复合型发酵羊乳有乳清析出且酸度偏高，可能是由于B发酵剂添加质量分数过多，羊乳发酵过度，使制品酸度偏高。当B发酵剂添加质量分数为1%时，复合型发酵羊乳凝固性好，色泽为乳白色，颜色分布均匀，具有发酵羊乳特有的风味，有苹果口味，酸度合适，甜度合适。故而B发酵剂最佳添加质量分数为1%。

表5 复合型发酵羊乳感官评定Table 5 Sensory evaluation of compound fermented goat milk

2.7 发酵剂添加质量分数对复合型发酵羊乳理化指标的影响

由图2可知，B发酵剂添加质量分数的变化对复合型发酵羊乳蛋白质、脂肪和非脂乳固体含量影响较小，没有显著性差异，所测定指标符合国家标准要求[17]。综合复合型羊乳的感官指标和理化指标，B发酵剂最佳添加质量分数为1%。

图2 发酵剂添加质量分数对复合型发酵羊乳理化指标的影响Fig.2 Effect of content of starter cultures on the physicochemical properties of compound fermented goat's milk

2.8 不同发酵羊乳抗氧化能力的测定

由表6可知，相较于苹果酵素发酵羊乳，双歧杆菌发酵羊乳、B发酵剂发酵羊乳和复合型发酵羊乳对DPPH自由基清除率明显增加，分别增加了2.01%、4.88%和8.91%，存在显著性差异（P<0.05）。苹果酵素的抗氧化能力与其所含的小分子糖、多糖、多酚类化合物及超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分含量有关[26-27]。将苹果酵素与复合发酵剂联合使用时，复合型发酵羊乳中不仅含有小分子糖、多糖、多酚类化合物[9]，同时乳酸菌将羊乳中的蛋白质降解成具有一定抗氧化活性的小分子肽，其DPPH清除能力较强，从而提高了发酵羊乳的抗氧化活性[28]。

表6 不同发酵羊乳抗氧化能力的测定Table 6 Determination of antioxidant capacity of different fermented goat milk

3 结 语

苹果酵素含有小分子糖、多糖、多酚类化合物及SOD等活性成分，具有较强的抗氧化能力。优化了苹果酵素复合发酵剂制备发酵羊乳的方法，并结合发酵羊乳的感官和理化指标，确定了最佳发酵工艺。当苹果酵素添加质量分数为4%，B发酵剂添加质量分数为1%时，复合型发酵羊乳凝固性好，色泽为乳白色，颜色分布均匀，具有发酵羊乳特有的风味，同时具有苹果口味，酸、甜度合适。对DPPH自由基清除能力为95.17%，相比于B发酵剂发酵羊乳，其DPPH自由基清除能力得到增强。为发酵羊乳制品的进一步研究与开发、工业化生产和生物功能研究提供一定参考。