miR-96干扰NKD2表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响

张建业，张卫华

(武汉科技大学附属汉阳医院，武汉市汉阳医院骨一科，湖北 武汉 430000)

骨肉瘤是一种常见于儿童及青少年的恶性肿瘤，其发病率居小儿骨恶性肿瘤首位[1]。骨肉瘤细胞来源于间质细胞，由于肿瘤可直接或间接由软骨形成肿瘤骨样组织及骨组织，故骨肉瘤生长迅速严重危害患者生活质量与生命安全[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一类长度约为21nt的小分子RNA，miR是一种内源性非编码RNA分子，但其可通过调节蛋白质的合成，进而参与多个细胞生物活动过程[3]。既往研究显示，miR-96在胃癌[4]、肝癌[5]、宫颈癌[6]等多种恶性肿瘤中呈异常表达。裸露角质蛋白同源物2(naked cuticle homolog 2，NKD2)是Wnt信号通路的下游靶基因，研究发现其对结肠癌[7]、胃癌[8]细胞的增殖与侵袭具有调控作用。但关于miR-96与NKD2对骨肉瘤细胞增殖与生长的影响，及其两者的相互作用尚不明确。故本研究旨在探究miR-96通过NKD2的表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析我院2013年9月至2018年2月收集的骨肉瘤标本57例临床资料作为研究组，同时收集距肿瘤边界5cm的癌旁组织作为对照组。纳入标准：(1)经病理学检查确诊为骨肉瘤；(2)本次治疗前未接受放疗、化疗及其他系统抗癌治疗。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并糖尿病、高血压等全身性疾病；(3)心、肝、肾等重要脏器存在严重功能障碍。其中男性39例，女性18例；年龄21～49岁，平均年龄(28.16±6.73)岁。世界卫生组织(world health organization，WHO)标准分型：小圆细胞型2例，软骨母细胞型6例，血管扩张型4例，纤维母细胞型5例，骨母细胞型40例。本研究符合本院医学伦理委员会相关规定。

1.2 主要仪器与试剂 人正常成骨细胞系hF0B1.19和人骨肉瘤MG63细胞株：购自上海联迈生物工程有限公司。恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9012)；实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)仪(上海宏石医疗科技有限公司，型号：SLAN-96P)；流式细胞仪(德国贝克曼库尔特，型号：FC500)；组织裂解液、细胞裂解液(上海信裕生物科技有限公司)；Trizol试剂盒(上海名劲生物科技有限公司)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)高糖细胞(上海冠导生物工程有限公司)；miR-96抑制剂(武汉博欧特生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(焦作路非凡生物科技有限公司)；兔抗人NKD2单克隆抗体、羊抗兔IgG(北京纽朴生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium assay，MTT)(上海恪敏生物科技有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(上海嵘崴达实业有限公司)；超敏电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒(上海羽朵生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 骨肉瘤细胞培养及miR-96表达检测 正常成骨细胞系hF0B1.19培养在10%胎牛血清DMEM高糖细胞培养液中，培养条件为：34 ℃、5% CO2；骨肉瘤细胞MG-63培养在10%胎牛血清培养基中培养，培养条件：37 ℃，5% CO2；转染前一天进行细胞在培养板中接种，保证次日转染时细胞处于对数生长期。次日取对数生长期的骨肉瘤细胞MG-63与正常成骨细胞系hF0B1.19，根据说明书采用TRIzol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳法评估RNA的完整性，把总RNA根据逆转录试剂盒说明书操作进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，参照RT-qPCR试剂盒说明书，采用RT-qPCR仪进行定量检测。引物序列：miR-96正向5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。NKD2正向5'-GACTTTGGACCATGAAGACCAG-3'，反向5'-GCCCAGACGGAAGTTTCTTATT-3'。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，60 ℃退火34 s，共40个循环，采用U6作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-96的相关表达量。

1.3.2 细胞分组 选取对数生长期骨肉瘤细胞MG-63，分为miR-96抑制组及空白对照组，应用LipofectaminTM2000说明书操作分别进行miR-96抑制组及空白对照组转染，转染24 h后分别采用RT-qPCR法与Western blot法检测各组人骨肉瘤MG63细胞中miR-96与NKD2蛋白表达水平；采用MTT法检测各组细胞增殖情况；采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况与细胞周期分布情况。

1.3.3 Western blot法检测蛋白miR-96与NKD2表达 将组织与细胞充分裂解，离心后取上清液，提取其中总蛋白。总蛋白中加入上样缓冲液后进行沸水浴10 min使蛋白充分变性，此后依次经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、转膜、封闭、兔抗人NKD2单克隆抗体(货号：AR1017)孵育、二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(货号：BA1054)孵育，采用超敏ECL化学发光试剂盒进行蛋白检测，用凝胶成像仪观察结果。

1.4 观察指标 骨肉瘤组织中miR-96与NKD2蛋白的表达情况；各组骨肉瘤细胞中miR-96与NKD2的表达情况；各组骨肉瘤细胞增殖、凋亡与细胞周期变化情况。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0数据软件对本研究数据进行统计与分析。其中计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。设检验水准为0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨肉瘤组织与癌旁组织中miR-96与NKD2蛋白的表达情况比较 RT-qPCR检测结果显示，骨肉瘤组织中miR-96表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；Western blot结果显示，骨肉瘤组织中NKD2蛋白表达水平明显低于癌旁组织，比较差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

注：与癌旁组织比较*P<0.05

注：与空白对照组比较*P<0.05

图3 两组骨肉瘤细胞中NKD2的表达情况

2.2 骨肉瘤细胞中miR-96与NKD2的表达情况比较 miR-96抑制组骨肉瘤细胞中miR-96表达水平明显低于空白对照组，比较差异具有统计学意义(P<0.05)；miR-96抑制组骨肉瘤细胞中NKD2表达水平明显高于空白对照组，比较差异有统计学意义(P<0.05，见图2～3)。

2.3 骨肉瘤细胞增殖情况比较 MTT比色检测结果显示，miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株经miR-96抑制剂转染48 h后，细胞相对吸光度(109.13±21.06)nm，未经miR-96抑制剂转染的空白对照组细胞相对吸光度(172.50±18.33)nm，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

注：与空白对照组比较*P<0.05

2.4 骨肉瘤细胞的凋亡情况比较 流式细胞仪检测结果显示，miR-96抑制组细胞凋亡率为(23.54±3.09)%，空白对照组细胞凋亡率为(1.79±0.62)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

注：与空白对照组比较*P<0.05

2.5 骨肉瘤细胞周期变化情况比较 miR-96抑制组MG63细胞株处于G0/G1、S、G2/M期的细胞分别占比62.41%、33.47%、3.64%，空白对照组MG63细胞株处于G0/G1、S、G2/M期的细胞分别占比47.39%、25.18%、27.62%，两组骨肉瘤MG63细胞株细胞周期情况比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤之一[1]。由于肿瘤组织的浸蚀与骨皮质溶解，肿瘤部位疼痛成为骨肉瘤患者最常见的症状。此外，患者还伴有肿瘤部位肿胀、疼痛性跛行及发热、体重下降、贫血等全身症状。骨肉瘤恶性程度高，预后极差，故而探究骨肉瘤的发病进程，找寻有效地治疗方法是临床亟需解决的问题。

近年来，miRNA在肿瘤中的表达及作用逐渐受到重视。研究报道，肿瘤组织与四周正常癌旁组织中对比有较多miRNA异常表达，而异常表达的miRNA可介导不同抑制癌及癌症基因的表达，使细胞中的信号传导通路或相关蛋白表达改变，从而发生抑癌或诱发癌症进展，但具体作用仍在进一步研究中[9]。miR作为一类基因调控因子，可靶向一个或多个mRNA，通过抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达，进而调控细胞生长、分化、凋亡与血管形成[10]。赵洪焕等[11]研究证明，miR可作为原癌基因或抑癌基因，在恶性肿瘤的发生、发展及转移、侵袭过程中发挥重要作用，为肿瘤的靶向治疗提供了新方向。赵新阳等[12]研究表明，miR-96在肝癌细胞表面呈高表达，且可促进肝癌细胞的迁移与侵袭。Rapti等[13]研究发现，miR-96在大肠癌中呈高表达，且高水平的miR-96提示患者预后不良。本研究结果显示，骨肉瘤组织中miR-96表达水平明显高于正常骨组织，提示miR-96在骨肉瘤组织中呈高表达。这与赵新阳[12]、Rapti等[13]的研究结果一致。Wnt信号通路在细胞增殖、器官形成、组织再生过程中具有重要作用，同时与多种恶性肿瘤的形成、发展有密切联系[14]。NKD2是Wnt信号通路的负调控因子[15]。Zhang等[16]研究发现，NIKD2在肝癌中呈低表达，NKD2表达缺失导致肝癌细胞生长加速。本研究发现，骨肉瘤组织中NKD2表达水平明显低于正常骨组织，提示NKD2在骨肉瘤中呈低表达。

体外细胞实验结果显示，miR-96抑制组骨肉瘤细胞中miR-96表达水平明显低于空白对照组，且miR-96抑制组骨肉瘤细胞中NKD2表达水平明显高于空白对照组，提示miR-96对NKD2的表达具有调控作用。细胞吸光度是指光线通过细胞前的入射强度与通过细胞后的透射光强比值，吸光度法是常用的细胞数量测量方法[17]。miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株经miR-96抑制剂转染48h后，细胞相对吸光度明显低于空白对照组，miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株细胞凋亡率明显大于空白对照组，提示miR-96可促进人骨肉瘤MG63细胞增殖，同时抑制其凋亡。此外，本研究还发现，miR-96抑制组G0/G1期细胞率较空白对照组骨肉瘤MG63细胞株增加，但G2/M期细胞率较空白对照组减小。G0/G1期细胞停止细胞分裂，G2/M期细胞有丝分裂旺盛[18]。这进一步提示miR-96可增加骨肉瘤MG63细胞增殖活性。

综上所述，miR-96在骨肉瘤组织中呈高表达，NKD2呈低表达；miR-96通过促进NKD2表达而促进骨肉瘤MG63细胞株早期凋亡；抑制骨肉瘤MG63细胞株生长；但关于NKD2是否成为骨肉瘤基因指标的潜在靶点还应当进一步研究确认。