动态浊度法定量检测注射用氟氧头孢钠中细菌内毒素的含量

季文君,方 韵,戴国英,陈 莉

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104)

1988年日本盐野义制药株式会社研发上市的注射用氟氧头孢钠(flomoxef sodium)是一种新型的氧头孢烯类广谱抗生素，其对厌氧菌、革兰阴性菌及革兰阳性菌均有很强的抗菌作用[1-2]。临床上主要用于治疗敏感致病菌引起的中重度感染(包括呼吸道感染、尿道感染、妇科感染、外科感染及儿科感染等)[3-4]。

细菌内毒素是一种脂多糖物质，存在于革兰阴性菌细胞壁上，细菌死亡或自溶后会进入机体，并刺激单核巨噬细胞生成多种细胞因子，过量会引起发热、低血压、多器官功能衰竭等一系列热原反应[5-6]。因此，细菌内毒素检查是保障注射剂用药安全的重要参数之一。目前，内毒素检查方法使用的主要为凝胶法，为定性或半定量的方法，无法获得内毒素的准确含量。近年来，随着药品安全性检查和生产过程质控的要求日益严格，定性或半定量的方法已经无法满足质控和检验的要求。因此，本试验参照2020年版《中国药典》四部通则中细菌内毒素检查法[7]，通过标准曲线的可靠性试验和干扰预试验，开发了用于氟氧头孢钠的内毒素定量检测动态浊度法，对注射用氟氧头孢钠的细菌内毒素进行定量检测。同时，本研究对方法的准确性和精密度进行了验证，探索使用该方法对注射用氟氧头孢钠中细菌内毒素进行定量检测的可行性，为产品生产过程中的内毒素含量监控和成品的检查提供技术支持。

1 材料

1.1 药品与试剂

细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号150601-201782，效价60 EU/支)；细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号1605250，规格30 ml/瓶)；动态浊度法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号1701221，规格1.25 ml/支，检测范围50～0.005 EU/ml)；细菌内毒素检查反应板(湛江安度斯生物有限公司，批号1702140)；注射用氟氧头孢钠(日本盐野义制药株式会社，批号DC24、DC25、DC26，规格1 g)。

1.2 仪器

ELX808IV细菌内毒素定量仪(美国BioTek公司)；TZL-5009可调速旋涡混匀器(苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据公式计算注射用氟氧头孢钠的细菌内毒素限值(L)。L=K/M，其中K为细菌内毒素阈剂量，注射剂，K=5 EU/(kg·h)；M为临床患者每千克体重每小时的最大供试品用量，成人体重按60 kg计算[7]。注射用氟氧头孢钠临床每次最大用量为2 g，静脉滴注30～60 min。据此计算，本品的细菌内毒素限值。见公式1。

公式(1)

但是经查阅日本药局方第17版规定，注射用氟氧头孢钠的细菌内毒素限值为0.025 EU/mg[8]。因此，为了用药安全，本研究选用较为严格的0.025 EU/mg作为本品的限值。

2.2 标准曲线的可靠性考察

取细菌内毒素检查(BET)用水1 ml对细菌内毒素工作标准品进行复溶，并进一步稀释，使其细菌内毒素最终浓度为1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，各取0.1 ml加入到无热原反应板中，再加入0.1 ml动态浊度法鲎试剂，混合均匀后立刻放入到细菌内毒素定量仪中进行检测，每一浓度平行做3个复孔；同时用BET水作阴性对照，平行2个复孔。根据表1得到的标准曲线回归方程logT=6.00-0.258logC，相关系数r=0.999>0.980，各平行孔的变异系数(CV)均<10%，阴性对照(NC)的反应时间大于规定检测时间，故标准曲线成立。

表1 细菌内毒素标准曲线及可靠性 n=3

2.3 最大有效稀释倍数的确定

在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数就是供试品的最大有效稀释倍数(MVD)，通常用MVD=cL/λ公式来计算，其中c为供试品溶液的浓度[7]，取1瓶注射用氟氧头孢钠(1 g)用10 ml BET水复溶，c初始为100 mg/ml；L为供试品注射用氟氧头孢钠的细菌内毒素限值，L=0.025 EU/mg；λ为动态浊度法中标准曲线最低点浓度0.01 EU/ml。经计算，MVD为250倍。见公式2。

公式(2)

2.4 供试品干扰预试验

取批号为CD24的氟氧头孢钠作为干扰预试验的供试品，用10 ml BET水复溶，再根据MVD的结果，用BET水依次稀释5(20 mg/ml)、25(4 mg/ml)，50(2 mg/ml)和250倍(0.4 mg/ml)，作为供试品溶液的4个梯度，同时制备含上述供试品浓度并含内毒素浓度(λm)0.25 EU/ml的溶液作为供试品回收溶液，分别取上述供试品溶液、供试品回收溶液、阴性对照溶液和系列浓度的标准品溶液进行检测，每一浓度平行2个复孔。根据标准曲线回归方程计算供试品回收溶液中细菌内毒素的含量，并确定内毒素的回收率。

表2结果显示，供试品溶液浓度为20 mg/ml时，回收率低于50%，存在干扰作用；供试品溶液浓度为4、2和0.4 mg/ml时，内毒素回收率分别是90%、91%和105%，均在50%～200%范围内。本研究选择内毒素的回收率最接近100%的0.4 mg/ml作为检测浓度，此时对检测结果的干扰较小。

表2 干扰预试验的结果

2.5 准确性验证

取批号为CD24的供试品，用10 ml BET水复溶后，稀释250倍制备成浓度为0.4 mg/ml的供试品溶液，同时制备含有不同浓度内毒素标准品的供试品回收溶液,使其中标准内毒素终浓度分别为1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，氟氧头孢钠含量为0.4 mg/ml。测定2个复孔，计算细菌内毒素的回收率以及CV。

结果显示，含不同浓度标准内毒素的0.4 mg/ml注射用氟氧头孢钠供试品的内毒素回收率在87%～120%，均在50%～200%范围内，且CV均<10%，表明该方法具有较好的准确性，见表3。

表3 动态浊度法的准确性验证

2.6 精密度验证

将细菌内毒素工作标准品配制成标准曲线中4个浓度(1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml)的标准内毒素标准溶液，用建立的动态浊度法进行检测，重复3次独立试验，计算每个浓度3次检验结果的CV。

结果显示，CV均<10%，表明该方法的精密性较好，见表4。

表4 动态浊度法的精密性验证

2.7 供试品的动态浊度法定量检测

使用细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准系列溶液，浓度为1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，另取BET水作为阴性对照。取3批氟氧头孢钠供试品(DC24、DC25、DC26)，按照上述干扰预试验项下的方法制备浓度为0.4 mg/ml的供试品溶液及供试品回收溶液，用建立的方法检测，每一浓度平行2个复孔，根据标准曲线计算供试品溶液的内毒素含量，以及供试品回收溶液中内毒素的回收率。

结果显示，对3批注射用氟氧头孢钠进行内毒素检测，供试品回收溶液中细菌内毒素的回收率均接近100%，供试品溶液均未检出内毒素，结果符合规定，见表5。

表5 样品动态浊度法定量检测结果

3 讨论

注射用氟氧头孢钠具有抗菌效果好、抗菌谱广的优点，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有较强的抗菌活性，在临床上主要用于呼吸系统感染、消化系统感染、泌尿生殖系统感染[9-10]。作为注射剂型，控制其细菌内毒素的含量对于用药安全有重要意义。

已有文献报道[11]，可以采用鲎试剂凝胶法检测注射用氟氧头孢钠中的细菌内毒素，但传统的凝胶法只能进行定性。动态浊度法也是常见的细菌内毒素定量检测方法，相较于凝胶法具有操作简便、可定量检测、检测范围宽、准确性好、灵敏度高等优点[12-13]。因此，本研究期望通过建立动态浊度法检测注射用氟氧头孢钠中细菌内毒素含量，从而更好地对产品进行质控。

本研究首先考察了氟氧头孢钠本身对细菌内毒素检查的干扰。结果显示，高浓度的氟氧头孢钠(20 mg/ml)确实对动态浊度法的检测存在干扰，但是随着样品含量的逐渐降低，干扰作用也逐渐减小；当样品终浓度在0.4 mg/ml时，采用动态浊度法定量测定注射用氟氧头孢钠中细菌内毒素含量，回收率最接近100%，对内毒素测定的干扰较小。因此，本文最终选择0.4 mg/ml的氟氧头孢钠作为最终检测浓度。随后我们对该方法的准确性和精密度进行了验证，结果显示其具有较高的准确性和精密度。采用该方法对3批注射用氟氧头孢钠的细菌内毒素含量进行检测，内毒素含量均小于检测限，检查结果符合规定。

由此可见，动态浊度法可以用于注射用氟氧头孢钠中细菌内毒素含量的定量测定，且该方法灵敏度高、重现性好，可以更好地满足产品细菌内毒素的质量控制要求。