开胸顺气丸中槟榔的HPLC含量测定及鉴别方法

于姗姗，齐 红，李 敏，张秋红

(济南市食品药品检验检测中心，济南 250102)

开胸顺气丸为传统中药制剂，质量标准首次收载于《中国药典》1963年版一部，历版《中国药典》均有收载，现行标准收载于《中国药典》2020年版一部。开胸顺气丸由槟榔、炒牵牛子、陈皮、木香、姜厚朴、醋三棱、醋莪术、猪牙皂8味中药组成，具有消积化滞、行气止痛的功效，临床常用于气郁食滞所致的胸胁胀满、胃脘疼痛、嗳气呕恶、食少纳呆等。《中国药典》2020年版一部的质量标准为：采用显微鉴别法对处方中醋莪术、槟榔、炒牵牛子、陈皮、猪牙皂、姜厚朴和醋三棱进行了鉴别，采用薄层色谱鉴别法对处方中槟榔、姜厚朴、炒牵牛子、陈皮、木香进行了鉴别，采用丸剂项下的有关规定对剂型进行了检查，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)对姜厚朴进行了含量测定[1-2]。目前，关于开胸顺气丸的质量标准研究较多[3-5]，但是关于开胸顺气丸中槟榔的含量测定则研究较少。

槟榔具有消积、行气之功效，占开胸顺气丸处方量的24.5%，为该方的主药之一。研究表明[6]，若服用不当，槟榔具有口腔毒性、肝毒性、肾毒性、生殖毒性，继而可引发口腔癌、肝癌等。槟榔的主要活性成分及毒性成分均为生物碱类，含量为0.3%～0.7%，主要包括槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱，其中又以槟榔碱为主[7]。

《中国药典》2020年版一部中仅仅用薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)鉴别开胸顺气丸中的槟榔，无槟榔的含量测定方法。本研究建立开胸顺气丸中槟榔碱的HPLC含量测定方法和槟榔的HPLC鉴别方法，为提高开胸顺气丸中槟榔的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵、SPD-M20A紫外检测器、CTO-10AS VP柱温箱、SIL-20A自动进样器(日本岛津公司)；AE-240电子分析天平、AE-100电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-600GDV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

开胸顺气丸(山东新大陆制药有限公司，批号1908093；山东孔圣堂制药有限公司，批号1904065；山东华洋制药有限公司，批号200301X；北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号20083328；仲景宛西制药股份有限公司，批号191201)；槟榔对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120915-201813)，氢溴酸槟榔碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号111684-202003，按99.8%计)，去甲槟榔碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号B26396，按98%计)；乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定

2.1.1色谱条件

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.01%磷酸溶液(每1000 ml含2.5 g十二烷基硫酸钠，32∶68)；检测波长为215 nm。理论板数按槟榔碱峰计算应不低于3000。

2.1.2溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 取氢溴酸槟榔碱对照品、去甲槟榔碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含氢溴酸槟榔碱约12 μg、去甲槟榔碱约 2 μg 的混合对照品溶液，即得(槟榔碱重量=氢溴酸槟榔碱重量/1.5214)。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 取本品研细，过五号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2.3 阴性对照溶液的制备 按开胸顺气丸处方比例制备不含槟榔的阴性样品,按“2.1.2.2”项下的方法制备阴性对照溶液。

2.1.3专属性试验

在拟定的色谱条件下，分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱图见图1。

A：对照品；B：供试品；C：阴性对照图1 HPLC色谱图

结果显示，阴性对照溶液与对照品溶液、供试品溶液在相应位置上无相同保留时间的色谱峰，表明该方法专属性良好。

2.1.4线性关系考察

取氢溴酸槟榔碱对照品、去甲槟榔碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含氢溴酸槟榔碱116.415 μg、去甲槟榔碱17.68 μg的混合对照品溶液。取5、7、10、15、20 μl分别注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘得标准曲线。结果见表1。

表1 回归方程、检出限及定量限结果

去甲槟榔碱在8.84～35.36 ng范围内线性关系良好，氢溴酸槟榔碱在58.21～232.84 ng范围内线性关系良好。去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的检出限及定量限均符合本次试验准确度和精密度的要求。

2.1.5重复性试验

称取同一样品(批号1908093)各6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的含量，计算RSD(n=6)。结果：去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的平均含量分别为0.14 mg/g、1.08 mg/g，RSD分别为1.7%(n=6)、1.5%(n=6)。表明该方法重复性良好。

2.1.6稳定性试验

取“2.1.5”项下第1份供试品溶液适量，分别放置2、4、6、8、10、12 h后进样测定，计算RSD(n=6)。结果：去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的RSD分别为2.0%(n=6)、1.9%(n=6)。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.7加样回收试验

取已知去甲槟榔碱含量(0.14 mg/g)和氢溴酸槟榔碱含量(1.08 mg/g)的开胸顺气丸(批号1908093)各6份，研细，取约0.25 g，精密称定，加入含去甲槟榔碱1.768 μg/ml、氢溴酸槟榔碱11.642 μg/ml的混合对照品溶液25 ml,再精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的峰面积，计算回收率。结果见表2、表3。

表2 去甲槟榔碱回收率试验结果

表3 氢溴酸槟榔碱回收率试验结果

结果：去甲槟榔碱平均回收率为53.3%，RSD为3.1%，准确度不达标，可能原因是去甲槟榔碱的含量低，导致其加样回收率试验结果偏低。氢溴酸槟榔碱平均回收率为93.2%，RSD为1.5%，准确度良好。

由此可见，建立的HPLC法适用于开胸顺气丸中槟榔的氢溴酸槟榔碱含量测定。根据《中国药典》2020年版一部槟榔项下对槟榔碱的规定为：含槟榔碱(C8H13NO2)不得少于0.20%，按饮片中槟榔碱最低含量折算，开胸顺气丸中含量应为0.25 mg/g，再按转移率为80%计算，暂定为本品每1 g含槟榔以槟榔碱(C8H13NO2)计，应不得少于0.20 mg。

2.1.8样品含量测定

称取5批样品粉末各约0.5 g，精密称定，按“2.1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别测定氢溴酸槟榔碱的含量。结果：5批供试品的氢溴酸槟榔碱平均含量为0.26～0.71 mg/g，均符合暂定的限度规定。

2.2 HPLC鉴别

按照《中国药典》2020年版一部中的方法，对开胸顺气丸中槟榔进行TCL鉴别。结果：斑点显色不明显，重现性差。见图2。

1:槟榔对照药材;2～6:供试品溶液图2 TLC鉴别

在建立HPLC法测定槟榔中去甲槟榔碱和氢溴酸槟榔碱的过程中发现，供试品与去甲槟榔碱、氢溴酸槟榔碱在相应位置上有相同保留时间的色谱峰，并且阴性对照无干扰，表明建立的HPLC法适用于槟榔中去甲槟榔碱和氢溴酸槟榔碱的HPLC鉴别。

3 讨论

3.1 HPLC含量测定

3.1.1测定成分的选择

杨雅蛟等[8]采用HPLC法同时测定了四磨汤中4种槟榔生物碱的含量，胡璇等[9]采用HPLC法同时测定了槟榔药材及其不同炮制品中4种生物碱的含量，屈文佳等[10]用HPLC法同时测定槟榔中4种生物碱的含量。笔者通过研究发现，开胸顺气丸中槟榔次碱和去甲槟榔次碱的含量低，在本研究的色谱条件下低于检出限，故仅对含量较高的去甲槟榔碱和槟榔碱的含量测定方法进行了考察。研究过程中发现，去甲槟榔碱的回收率较低，仅为51.4%～55.3%，低于《中国药典》2020年版四部“9101分析

方法验证指导原则”中“回收率限度85%～110%”的规定，故建立的HPLC法仅可用于测定开胸顺气丸中槟榔碱的含量。

3.1.2提取溶剂的选择

供试品的制备中，首先采用的提取溶剂为50%乙腈-0.5%磷酸溶液(50∶1)50 ml，毒性较大，配制相对繁琐，研究过程中，改用甲醇为溶剂进行提取，含量差异不明显，故以甲醇为提取溶剂。

3.1.3色谱系统的选择

胡璇等[9]在测定槟榔生物碱的过程中，考察了不同类型色谱柱的分离效果，最终选用了阳离子色谱柱。本研究选用了最常用的C18色谱柱及乙腈-磷酸-十二烷基硫酸钠的流动相进行试验，发现能得到较好的分离效果及色谱峰形，且较为经济实用。

3.2 HPLC鉴别

因槟榔的TCL鉴别、提取方法复杂，显色后只有一个斑点，且斑点显色不明显，重现性差。本研究选用HPLC法对开胸顺气丸中的槟榔进行鉴别，重现性好，成分控制更为合理，能同时控制去甲槟榔碱和槟榔碱。

综上所述，建立的开胸顺气丸中槟榔碱HPLC含量测定方法和槟榔HPLC鉴别方法，能有效控制开胸顺气丸中槟榔的质量，为其安全使用提供更好的质量控制标准。