香菇液体菌种培养基配方的比较试验

胡 宝 徐子昕 郭金英 王春霞 郑素月

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸056038）

香菇是我国主要的栽培食用菌种类之一，已有800多年的栽培历史[1]。近年来，我国食用菌产业正迎来“精准扶贫”“一带一路”等重大发展机遇，香菇产业成为许多地区农业经济的支柱产业。据中国食用菌协会统计，2019年我国香菇仍以1 151.9万t的产量居各类食用菌产量的首位。随着香菇产业的转型升级以及受菌棒出口利益的推动，我国出现了越来越多的香菇菌棒厂[2-3]。菌种培养是菌棒生产流程中关键环节。常规香菇菌种为固体菌种，存在生产成本高，容易感染杂菌，生长周期过长等缺陷[4-5]。液体菌种相比较固体菌种而言，具有制种简单、生产成本低、生长周期短、菌龄一致性好等优点，适用于工厂化生产菌棒[6]。试验主要研究不同培养基及其他培养条件对液体菌种培养的影响，以期筛选出适合规模生产应用的香菇液体菌种培养基配方，为香菇液体菌种生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

香菇0912，河北工程大学园林与生态工程学院食用菌研究室保藏。

1.2 供试培养基

试验共设计11个摇瓶培养基配方（均为1 000 mL）。配方①：土豆200 g，KH2PO43 g，葡萄糖20 g，MgSO41.5 g，维生素B 0.01 g；配方②：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，维生素B 2片；配方③：土豆200 g，红糖20 g，葡萄 糖15 g，蛋 白 胨5 g，酵 母 膏3 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO41 g，维生素B 2片；配方④：土豆200 g，木屑50 g，葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，KH2PO40.5 g，维生素B 2片；配方⑤：玉米粉20 g，麸皮20 g，葡萄糖10 g，酵母膏3 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，维生素B 2片；配方⑥：玉米粉10 g，豆粉7 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉1 g，蛋白胨1 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g；配方⑦：土豆200 g，红糖15 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3 g，豆粉3 g，玉米粉3 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO40.8 g，维生素B 2片；配方⑧：土豆200 g，葡 萄 糖20 g，KH2PO43 g，蛋 白 胨3 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，维生素B 2片，玉米粉1 g；配方⑨：土豆200 g，红糖10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3 g，KH2PO43 g，K2HPO43 g，豆粉3 g，玉米粉3 g，MgSO41 g，维生素B 2片；配方⑩：土豆200 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，MgSO41 g，KH2PO41 g。配方⑪：合成培养基12 g，麸皮6 g，玉米粉4 g，白砂糖6 g，蛋白胨1 g，豆油4 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

将香菇菌种接种到PDA综合培养基平板上，置25℃恒温箱培养，长满平板后备用。

1.3.2 培养基配制及接种和培养

按上述配方将11种培养基配制好后，装入500 mL摇瓶培养基中，每瓶装液量200 mL，加入10~20粒直径5 mm玻璃珠，封口灭菌。121℃灭菌30 min，冷却后接种。接种时用6 mm的无菌打孔器在活化菌株的菌丝边缘打孔，每个液体摇瓶接种8个菌饼块，静置培养24 h，置恒温震荡培养箱中，25℃，170 r/min恒温震荡培养。

1.4 观察记录

接种后第7天开始，观察测定摇瓶中菌液pH变化、菌丝锁状联合、生物量等指标。锁状联合计数方法是在10×40倍视野下计录每个视野下锁状联合数量，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 试验培养基液体发酵中的p H变化

测定11个香菇发酵配方的初始pH，从接种后的第7天开始，取样检测培养液pH，结果见图1所示。由图1可知，试验培养基配方初始pH有所不同，均6.0~7.0。在液体培养过程中，pH均呈下降趋势，但下降程度不同，说明香菇菌丝在试验培养基中生长和代谢能力有差异。根据香菇液体菌种的生物学特性，在培养过程中，初始pH为6.0~7.0，发酵终点pH3.0~4.0，其中配方⑤和配方⑦，pH变化适度。

图1 不同发酵时间菌液pH的变化

2.2 试验培养基p H和菌丝生物量的比较

试验培养基初始pH、发酵终点pH及菌丝生物量比较见表1。由表1可见，试验培养基的初始pH、发酵终点pH和生物量均不同。根据菌丝生物量干重并结合菌液培养过程中pH的变化，菌液初始pH均在6.0~7.0，菌液发酵终点pH多数在3.0~4.0，只有配方⑨pH从6.5下降到5.6，但菌丝生物量最低，为2.635 mg/mL。配方⑤菌丝生物量最高，为9.140 mg/mL，其次为配方⑦，为7.695 mg/mL，配方③为7.560 mg/mL，配方④为6.645 mg/mL。依据菌丝生物量干重测定情况，且工厂化生产中要求菌丝量越高越好，配方①、配方⑥、配方⑧、配方⑨和配方⑩五个配方菌丝生物量均在5.0 mg/mL以下，因此并非理想的配方。

表1 试验培养基的p H和菌丝生物量比较

2.3 香菇液体菌种活力判定及菌丝球形态观察

锁状联合是双核菌丝细胞分裂的一种特殊形式，也是结实能力的标志，锁状联合数量的多少直接反映菌丝体活力的强弱。试验配方培养的菌丝每个视野下锁状联合数量见表2（配方⑧和配方⑨未见明显菌丝球，未检测锁状联合）。由表2可知，试验培养基培养菌丝锁状联合数量不同，当摇瓶培养至第10天时，配方①和配方⑥菌丝锁状联合数量最多，平均每个视野中锁状联合数量均超过20个，培养至第11天时，锁状联合数量大部分呈下降趋势，其中，配方①和配方⑥下降最明显，配方②和配方④下降幅度相对较小。

表2 试验培养基培养菌丝球的锁状联合检测

培养基菌液及菌丝生长形态见表3、图2。通过肉眼观察菌液和菌丝形态，结合显微观察可初步判定菌丝是否退化或老化。

不同配方培养基的菌液颜色有明显差异，菌丝球也略有差异。试验多数配方培养基培养菌球呈毛刺球形，形似海胆；试验配方培养液中菌丝球量有一定差异，综合配方⑤、配方⑦，菌球大小比较均匀，量适中（表2、图2）。

3 小结与讨论

香菇液体菌种生产中，随着菌丝的生长，生物量的增加，菌液pH、菌丝锁状联合数量、菌丝形态等都会发生相应的变化，并因培养基不同有所差异，在生产中如何选择适宜的配方及快速的检测发酵终点方法，以便在香菇菌丝最好的生理状态下转接栽培袋，是急需解决的难题。综合11个配方液体培养香菇菌种过程中pH、菌丝球形态、菌液颜色等变化，筛选出较优良的4个配方，分别为配方⑤、配方⑦、配方③和配方④，可在香菇液体菌种工厂化生产上进一步推广应用。试验结果表明，香菇液体培养基初始pH6.0~7.0为宜，发酵终点pH3.0~4.0为宜。

表3 试验培养基中香菇菌液及菌丝球的形态特征

图2 试验培养基中香菇菌丝球的形态

有关菌丝出现退化、老化的特征有待进一步研究。