T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF检测技术在AIDS/TB人群中的诊断价值

姚正钢 陈勇毅 蓝梦颖

结核感染是艾滋病常见的机会性感染，结核病与艾滋病相互促进病变进展、恶化、加速导致患者死亡，HIV阳性患者感染结核菌后，结核病发病率较HIV阴性者高30倍，结核病已成为艾滋病毒感染者/艾滋患者中的一个主要死因[1]，早期诊断并进行及时有效的治疗对艾滋病合并结核病的预后至关重要[2]。艾滋病合并继发性肺结核（AIDS/TB）患者肺结核的临床表现不典型、肺部影像学不特异、痰涂片找抗酸杆菌阳性率低，在基层医院易漏诊、误诊，特别是早期诊断较为困难[3]。结核感染T细胞检测（tuberculosis T cell spot detection, T-SPOT.TB）及Gene Xpert MTB /RIF近年在临床得到推广，对提高肺结核诊断的准确性有较大的帮助[4-5]，由于这两种方法在艾滋病合并继发性肺结核研究较少，本研究通过对本院就诊患者的资料进行分析，探讨T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF在艾滋病合并继发性肺结核人群的诊断价值，以期为临床提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取 2019年1 月—2020年9 月在我院就诊的疑似肺结核患者323例的资料进行分析，所有纳入病例均进行T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB /RIF、痰涂片找抗酸杆菌、痰结核菌培养、抗HIV、CD4+淋巴细胞检查。所有入组患者均已获取知情同意，且签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。根据临床症状、实验室检查、影像学检查、病理学结果，按照诊断标准，将符合入组条件的病例分成两组：继发性肺结核患者（TB）组及艾滋病合并继发性肺结核患者（AIDS/TB）组。诊断标准：艾滋病的诊断标准参照《中国艾滋病诊疗指南（2018版）》[6]， 肺结核的诊断参照《肺结核的诊断标准 （WS288-2017）》[7]。继发性肺结核确诊标准：具备继发性肺结核影像学表现特征且符合以下条件之一：（1）2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；（2）分枝杆菌培养阳性，菌种鉴定为结核分枝杆菌复合群；（3）结核分枝杆菌核酸检测阳性；（4）肺组织或肺外组织病理学检查证实为结核病变。AIDS/TB组，除符合TB组的条件外，还要符合以下条件：（1）HIV抗体筛查试验阳性和HIV补充实验阳性；（2）CD4+T淋巴细胞计数＜350个/μL。纳入标准：（1）年龄大于18岁；（2）肺结核初治；（3）知情同意，能配合完成相关检查者。排除标准：（1）免疫抑制剂和免疫增强剂使用者；（2）合并其他免疫功能异常疾病者；（3）合并其他严重感染者。最终符合入组的患者209例，AIDS/TB组77例，TB组132例。

1.2 研究方法

1.2.1 T-SPOT.TB检测方法 试剂盒购自广东希格生物科技有限公司。抽取患者外周静脉血5 mL，加至含肝素的采血管中，然后按照T-SPOT.TB试剂盒的使用说明操作，阳性判断值参考说明书：当N孔斑点数≤10，P孔斑点数≥20或P孔斑点数≤19，T孔-N孔斑点数≥11为阳性；当11≤N孔斑点数≤20，P孔斑点数≥20或P孔斑点数≤19，T孔-N孔斑点数≥N为阳性；当N孔斑点数＞20，结果判断不确定。

1.2.2 Gene Xpert MTB/RIF检测 Gene Xpert及测试盒购自Cepheid公司。取研究对象1份晨痰或BALF样本,按《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》进行N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化处理,消化后的菌液重悬于1.1 mL的磷酸盐缓冲液中，取0.5 mL用于Xpert MTB/RIF系统检测。

1.3 观察指标

各组病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养检测阳性率；以临床诊断结果为参考标准，四种检测方法在AIDS/TB组患者中的敏感性及特异性；不同CD4+T水平艾滋病合并继发性肺结核患者T-SPOT.TB、Gene Xpert结果比较。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床诊断结果

最终符合入组的患者中，AIDS/TB组77例，TB组132例。AIDS/TB组77例患者中，男52例，女25例，平均年龄（45.2±15.8）岁；TB组132例患者中，男75例，女57例，平均年龄（48.4±17.3）岁。

2.2 四种不同检测方法的阳性率

各组病例T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养检测结果见表1。在AIDS/TB组中，四种检测方法的阳性率分别为T-SPOT.TB79.22%（61/77），Gene Xpert MTB/RIF 54.55%（42/77）、痰涂片36.36%（28/77）、痰培养40.26%（31/77）；在TB组中，四种检测方法的阳性率分别为T-SPOT.TB80.30%（106/132），Gene Xpert MTB/RIF 62.88%（83/132）、痰涂片41.67%（55/132）、痰培养57.58%（76/132），两组患者同种检测方法的阳性率比较：T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片阳性率经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05），两组患者痰培养阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。在艾滋病合并继发性肺结核患者中，T-SPOT.TB方法阳性率与其他三种方法比较差异有统计学意义（P＜0.001），而Gene Xpert、痰涂片、痰培养分别与另外三种方法比较只有部分有统计学差异：Gene Xpert与痰涂片比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与痰培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）；痰涂片与痰培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 四种检测方法阳性率（%）

2.3 四种检测方法在AIDS/TB组患者中的诊断效能比较

T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养诊断AIDS/TB组患者效能比较以临床诊断为参考标准，四种检测方法在AIDS/TB组患者中的敏感性及特异性情况见表2。该组患者中T-SPOT.TB敏感性达79.22%，明显较Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养的敏感性高，而特异性方面Gene Xpert达100%，高于其他方法。

表2 T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养诊断艾滋病合并继发性肺结核效能比较（%）

2.4 CD4+T淋巴细胞计数与T-SPOT.TB、Gene Xpert阳性率

在AIDS/TB组的77例患者中，CD4+T≥200个/μL的继发性肺结核中36例T-SPOT.TB阳性，阳性率59.02%，CD4+T＜200个/μL的继发性肺结核中25例T-SPOT.TB阳性率40.98%，两组阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。CD4+T≥200个/μL的继发性肺结核中Gene Xpert阳性率54.76%，CD4+T＜200个/μL的继发性肺结核中GeneXpert阳性率45.24%，两组阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同CD4+T水平艾滋病合并患者继发性肺结核T-SPOT.TB、Gene Xpert结果（%）

3 讨论

结核病是艾滋病最常见的机会性感染，与艾滋病互相促进病变进展、恶化，甚至迅速导致死亡。AIDS/TB患者中，继发性肺结核的临床症状、体征、实验室检查及影像学表现等与普通肺结核表现不一致，易造成临床误诊漏诊，如果能够尽早明确诊断，及时规范治疗后多数患者肺结核可以治愈，艾滋病预后也能改善，因此继发性肺结核的早期诊断非常重要。目前在基层医院，肺结核的检测方法有限，基本限于结核菌素试验、痰涂片、痰培养及胸部影像学检查，但结核菌素试验受影响因素较多，假阳性率高，痰涂片找抗酸杆菌操作虽然简单，但检出率低，阳性率仅40%左右，且涂片检出不能分辨活菌、死菌，不能鉴别结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌[8]；结核菌培养可以通过观察细菌生长情况并进一步进行菌种鉴定和药敏试验，但培养阳性率更低，且至少需要4周，时间较长，难以满足临床早期诊断的需求,而胸部影像学检查缺乏特异性。因此，基层医院需要探索更特异、敏感、快速、简单，能在基层医院开展的结核病诊断方法[9]。

T-SPOT.TB是将结核菌特异性抗原加入受试者的血液标本或者含有分离出的外周血单核细胞的培养基中进行孵化，如果受试者受到过结核分枝杆菌感染，那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放出γ-干扰素以及其他一些细胞因子，我们可以通过ELISA或ELISPOT方法定量检测γ-干扰素的释放水平，判断是否存在结核菌感染。T-SPOT.TB在普通肺结核应用有不少研究见于报道，具有高敏感性和高特异性，并且不受卡介苗和大多数非致病分枝杆菌的影响，T-SPOT.TB在结核诊断中的意义正在被越来越多的临床实验所证[5]，但在艾滋病合并继发性肺结核患者诊断应用研究较少。艾滋病由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起，HIV把人体免疫系统中最重要的CD4T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。CD4T淋巴细胞会否影响T-SPOT.TB结果，本研究通过观察在77例艾滋病合并继发性肺结核患者患者中，T-SPOT.TB阳性率79.22%（61/77），普通肺结核患者T-SPOT.TB阳性率80.30%，两组患者阳性率比较，经χ2检验，差异无统计学意义。艾滋病组患者中T-SPOT.TB敏感性达79.22%，敏感性明显高于Gene Xpert MTB/RIF、痰涂片、痰培养三种方法。本研究也观察到艾滋病组CD4+T≥200个/μl的患者T-SPOT.TB阳性率59.02%，CD4+T＜200个/μl患者的T-SPOT.TB阳性率40.98%，不同CD4+T细胞水平阳性率差异无统计学意义。因此，本研究观察到CD4T淋巴细胞水平与T-SPOT.TB结果没有明显相关性，T-SPOT.TB在艾滋病合并活动性肺结核患者中敏感性达79.22%，特异性89.29%，T-SPOT.TB对于诊断艾滋病合并继发性肺结核有临床价值[10]。但也要注意，T-SPOT.TB阳性不能区分活动性结核感染或潜伏的结核感染，诊断时需综合其他方法判断，T-SPOT.TB阴性时，可排除结核菌感染，在判断结核菌还是非结核菌感染时有较高临床价值[11]。

Gene Xpert MTB/RIF分子诊断系统，是全自动一体化的基于PCR方法的核酸检测系统，基于Gene Xpert平台的结核分枝杆菌及利福平耐药检测仅需2小时即可从原始标本获得结果，比传统的荧光定量PCR检测方法更准确、安全、快速，生物安全性要求不高，且能同时检测利福平耐药，可以在基层医院开展[12]。本研究显示艾滋病组患者中Gene Xpert敏感性达54.55%，特异性达100%，不同CD4+T水平患者在敏感性、特异性方面无统计学差异。特异性明显高于T-SPOT.TB、痰涂片、痰培养三种方法，在快速诊断方面有明显优势，但Gene Xpert检测的是基因片段，无法判断是死菌还是活菌，且由于采用痰标本，结果受痰标本质量影响[13]。

综上所述，诊断艾滋病合并活动性肺结核时，T-SPOT.TB具有较高的敏感性，Gene Xpert有较高的特异性，两者用于艾滋病患者合并继发性肺结核的辅助诊断有一定的临床价值。