牛羊布鲁氏菌cELISA与RBT、SAT 检测方法比较

韩 勇，韩永平，刘玉洁

（1.日照市畜牧兽医管理服务中心，山东日照 276800；

2.五莲县畜牧兽医管理服务中心中至镇畜牧兽医站，山东五莲 262300）

布鲁氏菌病（brucellosis），又称马尔他热或波状热，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患的自然疫源性传染病，常引起动物流产、不孕，故又称之为传染性流产病[1-4]。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。近年来，国内外多个地区有人畜感染发病的报告[5-6]。2014 年以来，为推动我国牛羊布鲁氏菌净化工作，提高动物疫病防控条件和管理水平，中国动物疫病预防控制中心印发了《规模化奶牛场和种羊场主要动物疫病净化技术指南》，要求在全国范围内开展“规模化养殖场主要动物疫病净化示范场”“规模化养殖场动物疫病净化创建场”（以下简称“两场”）评估认证工作，并于2015 年和2021 年先后对“两场”评估标准进行了修订。

2014 年以来，为做好布鲁氏菌净化工作，山东省日照市开展了检测方法优化筛选等净化关键技术研究。根据国标GB/T 18646—2018 中规定，虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）等方法为我国动物布鲁氏菌病血清学诊断技术。在现阶段大规模检疫检测中，血清学方法仍是最常用的诊断技术[7]。RBT 因操作简单，敏感性高，在实际应用中常作为初筛手段；SAT 则适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病血清学确诊。目前，市场上cELISA商品试剂盒种类繁多，为筛选敏感性高、可靠性好的试剂盒，本试验拟将2 种布鲁氏菌cELISA 试剂盒与RBT、SAT 方法进行检测比较分析，以期为快速、准确诊断牛羊布鲁氏菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原，购自青岛易邦生物工程有限公司；2 种布鲁氏菌cELISA 试剂盒（A、B），分别购自国内两家试剂公司。

1.2 血清样品

血清样品，为近年来本实验室检测样品和日照周围区县送检复核样本，均采自日照市，共计122 份。其中牛样本72 份，羊样本50 份。

1.3 主要仪器

酶标仪（MultIIskan GO），美国赛默飞公司生产；超纯水纯化系统（Cascada），美国PALL公司生产；恒温培养箱（DGX-9143BC），上海南荣实验室设备有限公司生产；单、多道移液器（BIOHIT），芬兰百得公司生产；高速冷冻离心机（5424R），德国Eppendorf 公司生产。

1.4 试验方法

RBT、SAT，参照动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T 18646—2018）步骤开展试验；cELISA 试剂盒检测，严格按照相应说明书进行操作。

1.5 cELISA、RBT 以及SAT 方法比较分析

为更好地评价3 种检测方法的可靠性，将cELISA 检测结果分别与RBT、SAT 进行比较，4 种分析指标为假阴性率、假阳性率、符合率和Kappa 值。假阴性率是指cELISA 检测为阴性用RBT/SAT 检测为阳性与RBT/SAT 检测所有阳性之和的百分比；假阳性是指cELISA 检测为阳性用RBT/SAT 检测为阴性与RBT/SAT 检测所有阴性之和的百分比；符合率是指cELISA 检测的阳性与阴性样本与两种检测方法（RBT、SAT）结果相一致的总和与所有检测样本的百分比。

Kappa 值是医学上常用的一种用于测评计数资料一致性的方法，是评价一致性的测量值，是一致性的统计指标，能够反映测量方法的相关程度。一般认为，Kappa 值＜0，一致性强度极差（实际情况下发生可能性较低）；0～0.20，一致性强度为微弱；0.21～0.40，一致性强度为弱；0.41～0.60，一致性强度为中度；0.61～0.80，一致性强度为高度；0.81～1.00，一致性强度为极强[8]。

2 结果

2.1 RBT、SAT、cELISA 检测

RBT、SAT、cELISA 试剂盒分别对122 份血清样品检测结果显示：经RBT 检测，阳性、阴性样品数量分别为43、79 份；经SAT 检测，阳性、阴性样品数量分别为40、82 份；经cELISA 试剂盒A 检测，阳性、阴性样品数量分别为39、83 份；经cELISA 试剂盒B 检测，阳性、阴性样品数量分别为38、84 份。

2.2 cELISA 与RBT 检测结果比较

用cELISA 和RBT 同时检测122 份血清样品，结果见表1。cELISA 试剂盒A 的假阴性率、假阳性率、符合率分别为25.58%、8.86%、85.25%，Kappa值为0.669。cELISA试剂盒B的假阴性率、假阳性率、符合率分别为30.23%、10.13%、82.79%，Kappa 值为0.613。

表1 cELISA 试剂盒A、B 和RBT 比较

cELISA 试剂盒A、B 和RBT 符合率均达到82%以上，Kappa 值均大于0.61，表明2 种试剂盒与RBT 符合率较好，已达到较为满意程度。

2.3 cELISA 与SAT 检测结果比较

用cELISA 和SAT 同时检测122 份血清样品，结果见表2。cELISA 试剂盒A 的假阴性率、假阳性率、符合率分别为10.00%、3.66%、94.26%，Kappa 值 为0.870。cELISA试剂盒B的假阴性率、假阳性率、符合率分别为15.00%、4.88%、91.80%，Kappa 值为0.812。

表2 cELISA 试剂盒A、B 和SAT 比较

3 讨论

试验表明，2 种cELISA 试剂盒与RBT、SAT的符合率达到82%以上，Kappa 值均大于0.61，显示了良好的一致性，适合作为布鲁氏菌净化检测方法。同时，将本试验所选的2 种cELISA 商品试剂盒在多家牛羊场应用，效果较好。

研究[9]表明，RBT 具有较高的敏感性，但有时会因S19 疫苗免疫或交叉反应而出现假阳性结果，偶尔会因前带现象引起假阴性反应；虽然其敏感性高、操作简单，但特异性低，只适合作为初筛[10]。本试验里，SAT 和cELISA 符合率更高，达到91%以上，在我国现行国标GB/T 18646-2018 中，SAT作为血清学确诊性试验，提示本试验所用的2 种cELISA 试剂盒检测效果良好。cELISA 是OIE 标准中规定的国际贸易布鲁氏菌病检测指定试验方法，操作简单、特异性强。牛、羊布鲁氏菌病血清学诊断方法种类较多，但目前还没有任何一种方法在敏感性、特异性以及操作简便程度、检测效率等方面都完美无缺。因此在布鲁氏菌净化检测时，需根据实际需要及经费预算选用合适的检测方法，建议两种或以上检测方法联合进行，效果较为理想。

虽然SAT 适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌血清学确诊，但病原鉴定和PCR 试验才是布鲁氏菌确诊的“金标准”。因此本试验对2 种cELISA试剂盒与RBT、SAT 的检测一致性开展比较，对测试cELISA 试剂盒检测效果有一定局限性，还需使用PCR 对检测结果进一步验证。此外，样本选择对试验结果具有较大影响。本试验虽然对122 份样本进行了研究，但样品数量仍然偏少。cELISA试剂盒样品存贮时间与来源是否具有代表性、阴阳性样品数量选择对试验结果的影响，需要在以后研究中进一步验证。

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌所引起的一种人兽共患传染病。牛、羊、猪最为常发，且可传染给人和其他家畜[11]，严重危害畜牧业生产与人体健康，开展净化迫在眉睫。日照市自2014 年开展布鲁氏菌净化工作以来，对布鲁氏菌检测方法等关键技术进行了集成研究，并在部分规模牛羊场进行了示范。目前全市已创建5 家“省级牛羊布鲁氏菌净化创建场”，日照市鲜纯奶业有限公司已申请“国家级奶牛布鲁氏菌净化创建场”认证。相关性分析显示，人间布鲁氏菌病与羊布鲁氏菌病的发生表现正相关性[12]，日照市通过多年布鲁氏菌病监测净化和大力宣传，畜间布鲁氏菌病得到有效控制，人间布鲁氏菌病病例总体也成下降趋势，说明畜间布鲁氏菌病的净化和防控对于预防人间病例发生具有积极意义。