固相萃取-超高效液相色谱法同时测定猪肉中22 种磺胺类药物残留

王宏宇，武云龙，赵栋皓，孙晓亮，李木子，曹旭敏，宋翠平，赵思俊，李 存

（1.天津农学院动物科学与动物医学院，天津 300384；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山西农业大学动物医学院，山西晋中 030801）

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的药物总称，具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉等特点，在兽医临床应用十分广泛。药物滥用、误用及不遵守休药期规定，会造成动物源食品中药物残留超标，既危害人类健康，还会诱导细菌产生耐药性。我国和欧盟均已制订了动物产品中的多种SAs 最高残留限量（MRL），其中我国规定SAs 总量不得超过0.1 mg/kg，奶中磺胺二甲基嘧啶不得超过0.025 mg/kg[1]。因此，对SAs 残留进行准确快速检测有着重要的食品安全意义[2]。

随着药物残留检测技术的不断发展，SAs 的前处理和检测方法越来越多。其中：前处理方法除了传统的液液萃取外，近年来还出现了许多新方法，如固相萃取（SPE）法、超声辅助分散液液微萃取法、磁性多壁碳纳米管法、基质固相分散法、QuEChERS 法等[3]；检测方法主要有高效液相色谱二极管阵列检测法（HPLC-PDA）、液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）、酶联免疫法等[2，4]。目前，我国已建立了多个检测标准用于猪肉中SAs 残留检测。《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20759—2006）中标定了牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和兔肉中16 种SAs 残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，《水产品中17 种磺胺类及15 种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077 号公告-1-2008）规定了17 种SAs 残留量的液相色谱-串联质谱法。但这些方法一次检测的药物种类较少，成本相对较高，且基质效应的存在会影响检测结果的准确度和灵敏度[5]。本研究拟采用固相萃取-超高效液相色谱法（SPE-UPLC-PDA），建立猪肉中22 种SAs 的一次性残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 AcquityTMUPLC-PDA 超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器，美国Waters公司；氮吹仪，美国Organomation 公司；漩涡混合仪，美国Talboys 公司；Milli-Q 纯水仪，德国Millipore 公司；5804R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；固相萃取装置、MCX 固相萃取柱（60 mg、3 mL），德国CNW 公司。

1.1.2 主要药品试剂 磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole，纯 度＞94%）、磺胺胍（sulfaguanidine，纯度＞98%）、磺胺醋酰（sulfacetamide，纯度＞97%）、磺胺吡啶（sulfapyridine，纯度＞98%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，纯度＞99%）、磺胺二甲异嘧啶（sulfisomidine，纯度＞98%）、磺胺二甲恶唑（sulfamoxole，纯度＞98.5%）、磺胺二甲异恶唑（sulfisoxazole，纯度＞98%）、磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，纯度＞99%）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，纯度＞95%）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，纯度＞96%）、磺胺甲氧吡嗪（sulfalen，纯度＞97%）磺胺间二甲氧嘧啶（sulfamethazine，纯度＞99%）、磺胺苯（sulfabenz，纯度＞96%）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole，纯度＞98%）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，纯度＞97%），均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。磺胺（sulfonamide，纯度＞99%）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，纯度＞99%）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadoxine，纯度＞98%）、磺胺氯哒嗪（sulfachloropyridazine，纯度＞97%），均购自Toronto Research Chemicals INC（加拿大）。磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，纯度＞98%）、磺胺噻唑（sulfathiazole，纯度＞99%）、磺胺氯吡嗪（sulfachloropyrazine，纯度＞98%），均购自WITEGA Laboratorien BerlinAdlershof GmbH（加拿大）。甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck 公司；甲酸、甲酸铵均为色谱纯，德国CNW 公司；乙酸、氨水均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水，由Milli-Q 纯水仪制得。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配置 分别准确称取22 种SAs标准品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制质量浓度为100 mg/L 的标准储备液，于-20 ℃避光保存；分别移取适量标准储备液，配制1 mg/L 的22 种SAs 混合标准储备液；分别移取适量的混合标准储备液，根据需要用甲醇逐级稀释为适当浓度的混合标准工作液，现用现配。

1.2.2 样品前处理 准确量取2 g 猪肉于50 mL具塞离心管中，加入8 mL 3%乙酸乙腈以及5 g 均质子，涡旋混匀，8 000 r/min 离心7 min，将上清移至新离心管，重复提取1 次，合并2 次上清，待净化。上清液通过经3 mL 甲醇、3 mL 水以及3 mL 3%乙酸乙腈活化的MCX 柱，分别用3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，用真空泵抽干后，以3 mL 5%氨化甲醇洗脱，45 ℃水浴条件下N2吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液复溶，涡动30 s 后，经0.22 μm 针孔式滤膜过滤，UPLCPDA 检测。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：UPLC CSH Fluorophenyl（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A（简称A）：含有10 mmol/L 甲酸铵的0.1%甲酸水；流动相B（简称B）：乙腈。流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，二极管阵列检测器波长270 nm，进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～2.0 min，13%B；＞2.0～3.5 min，13%～15%B；＞3.5～4.5 min，15%B；＞4.5～6.5 min，15%～35%B；＞6.5～8.8 min，35%B；＞8.8～9.0 min，35%～95%B；＞9.0～10.0 min，95%B；＞10.0～10.2 min，95%～13%B；＞10.2～12.0 min，13%B。

1.3 方法评价

1.3.1 试剂标准曲线绘制 配制质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的试剂标准溶液。经UPLC-PDA 进样分析，以质量浓度（μg/L）为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标，绘制试剂标准曲线。

1.3.2 检测限和定量限测定 准确量取2 g 空白样品，向其中添加不同质量浓度的混合标准工作液，按照1.2.2前处理方法对样品进行处理后上机检测。以10 倍信噪比（S/N=10）对应的样品浓度作为方法的定量限（limit of quantification，LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）对应的样品浓度作为方法的检测限（limit of detection，LOD）。

1.3.3 添加回收率和精密度测定 准确量取2 g空白样品，进行3 个水平（1、5、10 倍LOQ）的加标回收试验；按照1.2.2 前处理方法对样品进行处理后上机检测。每个水平做6 个平行，进行3 次批间重复；使用标准曲线进行校正，测定目标药物浓度，计算回收率、批内相对标准偏差和批间相对标准偏差。

1.3.4 实际样品检测 采用本试验建立的方法，对从山东省采集的18 份猪肉样品进行检测。18份样本经过3%乙酸乙腈提取、MCX 柱净化、UPLC-PDA 检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

由于同分异构体药物分离受限，故在流动相中加入一定量甲酸铵，使其能全部分离所有药物[6]。

磺胺类药物属于两性化合物，因此采用酸性流动相可使分离效果最佳。试验采用甲酸铵-甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相，用0.1%甲酸-乙腈作为流动相。虽色谱峰尖锐、对称，但不能分离所有药物，故在甲酸溶液中加入适量甲酸铵进行考察。结果显示，使用含有10 mmol/L 甲酸铵的0.1%甲酸水-乙腈作为流动相，能分离出所有药物且峰形较好。为了将本试验中的药物在尽可能短的时间内有效分离，本研究采用UPLC CSH Fluoro-phenyl 色谱柱分离所有药物，采用PDA 波长270 nm，可使SAs 检测获得较高的灵敏度[7]。SAs 标准溶液色谱图、空白样品色谱图和实际样品加标色谱图分别见图1-A、图1-B、图1-C。

图1 标准溶液、空白样品和实际样品加标色谱图

2.2 提取液优化

提取动物产品中的SAs 通常采用乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂或磷酸盐水溶液进行[8-9]。为了获得满意的回收率和较好的选择性，本试验选择有机溶剂和水溶液作为提取液进行优化比较。

2.2.1 有机溶剂 样品基质中的蛋白质等大分子杂质会因共萃取效应而被提取出来。由于蛋白质的最佳吸收波长为280 nm，与SAs 的检测波长较为相近，因此在紫外检测时容易影响SAs 检测的灵敏度和选择性。相关研究表明：乙腈可以沉淀牛奶等样品中的蛋白质，使蛋白质达到等电点沉淀[10]；而采用乙酸乙酯和甲醇进行提取，对组织样本中目标化合物回收具有良好效果[11]。为此，本研究分别采用乙酸乙酯、甲醇和乙腈提取样品，经MCX柱净化后，使用UPLC 检测，统计目标药物回收率。结果显示：乙酸乙酯和甲醇不能完全从样品中提取药物，受基质中的内源物质干扰较大，分离不佳，且由于溶剂性质原因[12]，大量脂溶性杂质溶于提取液中；而使用乙腈作为提取液时，除磺胺、磺胺醋酰外，回收率均高于80%。此外，还对乙腈的酸度进行优化分析，通过向提取液中加入乙酸或氨水等调节溶液pH。以乙腈、氨化（1%、3%、5%）乙腈、乙酸（1%、3%、5%）乙腈分别提取样本，比较不同提取液的提取效果。结果显示：使用3%乙酸乙腈，可有效提取猪肉组织中的SAs，可获得较好的回收率；增加乙酸使用量（5%），虽不影响药物回收率，但会增加萃取中杂质的干扰；而减少乙酸使用量（0、1%）时，可使SAs 回收率降低（＜80%）。

2.2.2 水溶液 本试验对PBS 溶液的提取效果进行了优化，分别对PBS 溶液的pH、浓度进行优化分析。首先优化PBS 提取液pH，分别使用pH3～6的PBS 溶液进行提取。结果显示：使用PBS 溶液（pH5）时，可提取猪肉组织中的SAs，并获得了较好的回收率。增加溶液pH（pH6）时，磺胺醋酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲恶唑回收率降低（＜80%）；而降低溶液pH（pH3、pH4），虽不影响药物回收率，但会增加萃取中杂质的干扰，故选择pH5 的PBS 溶液。此外，还对PBS 溶液浓度进行优化分析，分别使用0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mol/L 的PBS 溶液（pH5）提取样本。结果显示：使用0.5 mol/L PBS（pH5）溶液，可提取猪肉组织中的SAs，并获得了较好回收率；当PBS 溶液浓度过低时，磺胺、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺苯、磺胺对甲氧嘧啶的回收率小于80%；而提高PBS 溶液浓度，对目标药物回收率没有明显影响。故选择0.5 mol/L PBS（pH5）溶液作为最佳水溶液提取液。

2.2.3 两种提取液对比 对最优的有机溶剂提取液（3%乙酸乙腈）以及水溶液提取液（0.5 mol/L PBS，pH5）进行比较。分别使用两种提取液提取样本，经MCX 柱净化后，使用UPLC-PDA 检测。结果显示：以PBS 溶液、酸化乙腈作为提取液时，目标药物回收率均较高。但在试验过程中发现，以PBS 溶液作为提取液，在提取完成的待上样液中，含有大量白色絮状物，会堵塞SPE 柱，从而引起流速不稳甚至出现流不动的现象，导致试验结果平行性较差[13]。因此，本研究选择3%乙酸乙腈作为猪肉样品提取液。

2.3 净化条件优化

2.3.1 SPE 固相萃取柱选择 本研究选取1#（CNW-HLB 柱）、2#（Oasis HLB 柱）、3#（CNW-MCX 柱）、4#（PCX 柱）进行比较。标准添加量为50 μg/kg，经甲醇、水和上样液活化的SPE 柱富集，用甲醇或5%氨化甲醇洗脱，比较各SPE 柱对目标药物的富集效果。结果显示，1～4#的富集比例分别为90%、85%、90%和83%。结果表明，4 种SPE 柱均可富集SAs，且CNW 公司生产的HLB 柱（1#）以及MCX 柱（3#），对目标药物的富集效果较好。考虑到在试验过程中，由于提取液为乙腈，只有在过HLB 柱前氮吹至近干，再使用复溶液复溶后，才可继续进行净化步骤，因而容易导致目标药物损失[14]，且会浪费大量时间；而MCX 柱，由于其为阳离子交换柱，对pH 较为敏感，以3%乙酸乙腈作为提取液时，可以直接上样。故选择3#作为SPE 固相萃取柱。

2.3.2 洗脱液优化 按参考文献[15-16]，选择4种洗脱液，1%氨化甲醇、3%氨化甲醇、5%氨化甲醇、7%氨化甲醇，各取3 mL 洗脱液过已富集的MCX 固相萃取柱，比较洗脱效果。结果显示：5%和7%的氨化甲醇洗脱能力无明显差异（＞95%），可完全将药物从柱床中洗脱下来，1%氨化甲醇仅可洗脱下20%～40%，而3%氨化甲醇可洗脱下60%～80%，故选择5%氨化甲醇作为洗脱溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、相关系数、检出限和定量限以不同浓度的混合标准溶液进行测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制试剂标准曲线。结果（表1）显示：各药物线性关系良好，相关系数R2＞0.999。LOQ 为2.5～10.0 μg/kg，LOD为1.0～4.0 μg/kg。

表1 22 种兽药的保留时间、线性方程、相关系数和LOQ、LOD

2.4.2 准确度和精密度 22 种目标药物回收率及批内、批间相对标准偏差见表2。结果显示，回收率为80.4%～96.6%，批内相对标准偏差为1.1%～4.6%，批间相对标准偏差为2.5%～13.4%，可满足国际上对兽药残留的检测需求。

表2 22 种兽药的加标回收率和相对标准偏差

2.5 相对于UPLC-MS/MS 的优势

在使用UPLC-MS/MS 法时，基质效应（matrix effects，ME）的存在会影响检测结果的准确度和灵敏度[17]。经前处理样品中加入目标药物，进行UPLC-MS/MS 检测，绘制基质匹配标准曲线，通过计算各药物样本溶液与浓度相同的标准溶液之比的平均值，计算目标药物的基质效应[18]。结果显示：目标药物中有部分基质效应较强（ME ＜60%），包括磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶；部分基质效应很强（ME ＜40%），包括磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯。基质效应严重影响结果的准确度和灵敏度，且UPLC-MS/MS 成本较高，操作复杂。而本研究的UPLC-PDA 法不存在基质效应影响，在经前处理后杂质较少，且成本较低、操作简便，结果准确性较高，重复性良好。

2.6 实际样品检测

利用本研究建立的方法对从山东省采集的18份猪肉样品进行测定，结果未有SAs 检出。

3 小结

本研究建立的猪肉中22 种SAs 的SPE-UPLCPDA 检测方法灵敏度高、重复性好、成本低廉，且操作简单、快速，可以用于检测猪肉样品中的SAs 残留检测。