单分子免疫阵列技术在传染病诊断中的应用

樊晓旭，张皓博，刘蒙达，迟庆安，2，亓 菲，3，刘婷婷，孙淑芳，范伟兴

（1.中国动物卫生与流行病学中心，国家动物结核病参考实验室，山东青岛 266032；2.海南省动物疫病预防控制中心，海南海口 571100；3.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

传统ELISA方法的基本原理是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留了免疫活性，又保留了酶的活性。当受检物质与酶标抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶反应底物，催化显色，根据颜色反应的深浅或有无，定性或定量分析受检物质。由于酶的催化效率很高，故可放大反应效果，提高检测的敏感度[1]。但是，传统ELISA方法由于受读取方式限制，灵敏度仅达到皮摩尔（即pg/mL）水平，且需要将受检物质进行稀释以达到反应所需的体积。

1971年，Engvall和Perlmann报道了利用ELISA定量测定IgG的研究技术，使其成为测定液体样本中微量物质的方法。2014年，基于ELISA原理，美国Quanterix公司开发了单分子免疫阵列（single molecule array，Simoa）技术，用磁珠捕获免疫复合物，并单独封闭在Simoa圆盘的微孔中，遵循泊松分布进行分析，实现数字化形式的ELISA检测，又称“数字ELISA”[2]。

相比传统ELISA，Simoa技术具有6点优势：（1）灵敏度高。其灵敏度为传统ELISA技术的1 000倍以上，检测下限达到fg/mL，实现了超低丰度蛋白的有效检测和定量，节约珍贵样本，减少基质效应。（2）全自动化。基于Quanterix Simoa HD-1数字式单分子免疫阵列分析仪，试验过程不依赖操作人员，从而保证结果的重复性和精准性。（3）多重检测。能同时完成多达 10 种目标分子的检测。（4）重复性好。试验结果的批间变异系数（CVs）低于10%。（5）线性范围高。检测的动态范围超过4个数量级。（6）自主研发。可根据试验目的进行方案开发和优化，适合科研创新研究。为了解Simoa技术在传染病诊断中的应用情况，本文综述了其原理及在新冠病毒感染、肺结核、朊病毒病等传染病诊断中的应用进展。

1 原理

Simoa检测中，选取的是含有顺磁性的磁珠（直径2.7 μm），磁珠表面附着抗体捕获剂，具有10种荧光标记，包含25万个捕获抗体附着点。通常，将50万粒磁珠添加到100 μL样品中，使磁珠数量远大于目标分子数量。检测时，加入生物素标记的检测抗体以及亲和素偶联的酶和底物。顺磁性磁珠附着捕获抗体，特异性结合目标蛋白，再连接酶标抗体，引入阵列。将磁珠上样到Simoa圆盘后，磁珠在重力作用下沉积在阵列表面，其中一小部分落入反应孔中，其余浮在水面上。利用油将单个磁珠封闭在直径4.25 μm、深3.25 μm的反应孔（well）中进行反应，取代水介质和多余磁珠，同时避免信号扩散和交叉反应。每21.6万个反应孔组成一组阵列（array），每24个阵列再组成一张圆盘（disc），使用CCD摄像头捕获反应孔中超过阈值的检测信号，标记为“开孔（on well）”和“关孔（off well）”。通过计算“on well”在阵列中的比例，依据泊松分布理论，计算同时含有珠子和荧光产物孔的数量相对于含有珠子孔的总数的比值来确定测试样品中的蛋白质浓度（图1）。与传统方法相比，Simoa技术能够通过数字方式而不是通过测量全部模拟信号来确定浓度，因此这种检测单一免疫复合物的方法被称为“数字ELISA”。此外，磁珠可进行多重荧光标记，通过统计不同颜色荧光磁珠的“on well”数量，即可同步获得多个检测指标的浓度定量值[3]。

图1 Simoa 工作示意图[3]

Simoa技术的关键在于磁珠和超微量反应体系。在磁珠方面，磁珠与蛋白分子的比例大约为10:1的条件下，含有标记免疫复合物磁珠遵循泊松分布，即蛋白质在相对低浓度情况下，每个磁珠将捕获单一的免疫复合物或未发生捕获。例如，如果在0.1 mL（6万个分子）样本中捕获了1 fmol蛋白质并在50万个磁珠上标记，那么12%的磁珠将携带1个蛋白质分子，88%的磁珠不携带任何蛋白质分子。由于溶液中磁珠量大，磁珠间距很小，因此每个分子不到1 min可遇到1个磁珠，理论上所有分子都应该与多个珠子发生相遇。这样显著提高了与固定捕获表面的结合效率。之后清洗磁珠，去除非特异性结合蛋白，与生物素标记的检测抗体和β-半乳糖苷酶标记的链霉亲和素一起孵育。每一个捕捉到单个蛋白质分子的磁珠都被一种酶标记，而不捕获分子的磁珠保持无标记状态。

在超微量反应体系方面。Simoa技术将酶产生的荧光团限制在极小的体积（约40 fL，1 fL=10-15L），且每个孔反应体系仅为50 fL，约为ELISA反应体系的1/（20亿）。荧光产物分子局部浓度相对较高，不但提高了酶底物的反应效率，而且还指数级降低了荧光信号的扩散和背景信号的干扰，从而提高了对低丰度蛋白的检测灵敏度，使检测单分子变为可能。

2 应用

当前，Simoa技术可测量血清、血浆、脑脊液、尿液、细胞提取物等基质中的蛋白质，可应用于肿瘤、神经、免疫炎症和传染性疾病等领域，实现对极低含量的生物标志物超高灵敏度检测。例如，通过Simoa技术检测肿瘤每个发展阶段的生物标志物水平，辨别出生物标志物的微小变化，监测评估癌症发生风险，鉴别良性与恶性肿瘤细胞，评价患者对治疗的敏感度，从而为癌症早期诊断、治疗提供新的手段。传统技术只能在脑脊髓液中检测到低水平的神经学生物标志物，而Simoa技术能在更早阶段检测到血液中极低水平的标志物，为改善脑损伤和脑病的诊断方式提供可能[4]。在疾病初期，诸多关键炎症因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α等表达量极低。传统ELISA等方法受灵敏度的限制无法检测这些指标，导致研究中经常出现空缺值；基于Simoa技术，可提高灵敏性，成功检测血清和血浆中引发炎症的分子及抗炎症的分子，改善免疫性疾病的诊断和治疗效果。在传染病潜伏期和出现免疫反应前，Simoa技术可检测到生物标志物，实现更早期的诊断，显著降低传染病传播概率，从而为传染病筛查、治疗开发以及疾病监测提供帮助。

2.1 新冠肺炎诊断

2020年12月28日，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了紧急使用Simoa®半定量新冠病毒（SARS-CoV-2）IgG抗体检测授权书，批准使用全自动高通量免疫分析仪器Simoa HD-X Analyzer®检测并定量血清或EDTA血浆中IgG抗体。Simoa检测的目标是人体针对新冠病毒刺突蛋白区域产生的抗体，因此可通过检测疑似感染或最近密切接触者中的IgG抗体进行新冠肺炎诊断。临床研究结果显示，在PCR结果呈阳性后15 d或更长时间内，Simoa抗体检测敏感性达100%，特异性达99.2%。此外，新冠病毒的刺突蛋白包含多个亚单位，共同介导病毒进入人类细胞，是疫苗设计的作用靶点。因此，Simoa技术可用于测定疫苗免疫诱导的抗体反应。另一项研究利用Simoa技术开发了新冠病毒刺突蛋白、S1亚单位、核衣壳蛋白的抗原检测方法，检测限（LOD）分别为5 pg/mL（0.07 pmol/L）、70 pg/mL（0.39 pmol/L）和0.02 pg/mL（0.4 fmol/L）。在64例新冠病毒核酸检测阳性患者中，41例检测到S1亚单位和核衣壳抗原。在这些患者中，血清转化后（5±1）d，血浆中病毒抗原完全被清除，鼻咽RT-PCR检测结果呈阳性后（15±5）d，病毒抗原被清除。高浓度S1亚单位抗原患者与ICU入院率（77%）和插管时间（1 d内）的相关性有统计学意义[5]。这提示Simoa检测新冠病毒抗原的方法可帮助监测疾病感染进程。通过Simoa检测分析广泛的超敏感蛋白质生物标记物，包括关键的免疫调节细胞因子和趋化因子，有望实现早期高灵敏度诊断，以区分新冠肺炎轻症和重症患者。

2.2 活动性肺结核诊断

全世界约有17亿人为肺结核潜伏性感染者（LTBI），其中5%～15%会发展为活动性肺结核。对可能发展为活动性结核病的潜伏感染患者需要及时采取治疗，以避免出现耐药性问题。目前，迟发型超敏反应皮试试验、γ干扰素释放分析（IGRA）均无法区分潜伏性感染和活动性结核，虽然QuantiFERON®-TB Gold Plus对IGRA作了进一步改进，选取结核分枝杆菌特异性蛋白（ESAT-6和CFP10）作为刺激抗原刺激感染患者产生γ干扰素并进行定量，但是当阳性对照值较低或阴性对照有较高的背景反应时，所得到的结果被认为是“不确定的”。这种不确定结果通常与淋巴细胞减少、人免疫缺陷病毒（HIV）感染或免疫抑制治疗导致的免疫缺陷有关。基于Simoa技术，γ干扰素检测较IGRA方法灵敏度提高100倍，能够进一步鉴别IGRA不确定结果中的真阳性和阴性样本，进而帮助针对不同患者采取相适应的临床管理措施[6]。

利用Simoa技术测定活动性肺结核患者接受治疗前后尿中总IP-10及其激动剂/拮抗剂的含量，并将健康献血者和肺炎患者作为对照。结果显示：与健康献血者相比，活动性肺结核患者的总IP-10和激动剂IP-10水平显著升高；相反，活动性肺结核患者的IP-10水平与肺炎患者的IP-10水平没有差异。IP-10水平升高与肺结核和肺炎相关，提示其变化与急性炎症有关[7]，说明利用Simoa技术检测IP-10，有望帮助诊断活动性结核病，监测结核病治疗效果。

2.3 艾滋病诊断

定量病毒生长分析（QVOA）是一种检测逆转录病毒复制能力的体外病毒诱导试验方法，但其精度和动态范围有限，且需要的细胞数量庞大。通常，检测到可诱导的病毒RNA并不一定表明产生了子代病毒，更准确的是检测具免疫相关性的病毒蛋白含量变化，但传统ELISA在灵敏度上不能满足要求。基于此，人们开发了超灵敏p24定量分析的Simoa技术测定HIV生长。选取1 μL培养细胞进行Simoa检测，在感染后第14天通过超敏感Simoa技术（检出限为0.003 pg/mL，定量限为0.01 pg/mL）测量发现上清液中存在HIV p24，而直到第21天采用标准ELISA（检出限为4.3 pg/mL，定量限为6.25 pg/mL）才发现上清液中存在HIV p24[8]。在一项针对成人患者抗逆转录病毒治疗研究中，利用Simoa技术测定病毒生长发现，HIV的指数级复制只发生在CD32-CD4+T细胞中（平均变化=17.46 pg/mL，P=0.038）。在CD32hi CD4+T细胞中诱导的前病毒复制水平较低，随着时间的推移没有显著增加（平均变化=0.026 pg/mL，P=0.234），并且仅能通过Simoa技术检测到，提示在围产期已感染HIV的青少年中，潜伏感染过程中病毒主要储存在CD32-CD4+T细胞中，这为制定针对性的治疗策略提供了参考和依据[9]。同样，在评价猴免疫缺陷病毒（SIV）生长中，基于Simoa建立了一种超灵敏的SIV-Gag-p27检测方法。该方法的定量限（LOQ）为0.1 pg/mL，灵敏度是传统ELISA的100倍，线性范围为0.08～250.00 pg/mL（传统ELISA的线性范围为62.5～2 000.0 pg/mL）。Simoa技术可提高早期诊断的灵敏性，相比传统ELISA，提前6 d检测到阳性，且与SIV-RNA病原学检测结果高度一致，从而帮助评估非人灵长类动物中传染性SIV的持续复制和再激活情况[10]。

2.4 朊病毒病诊断

羊瘙痒病是由朊病毒感染绵羊和山羊引起的一种致命的神经退行性疾病。羊瘙痒病的早期诊断依赖于脑组织中病理性朊蛋白的检测。目前还无法通过检测血液生物标志物实现活体动物的痒病确诊。神经丝光蛋白（NfL）是一种68 kDa的细胞骨架中间丝蛋白，在神经元轴突中表达，并在神经元受损时释放到脑脊液（CSF）和血液中，可作为一种新的生物标志物，用于神经退行性疾病和其他人类神经疾病的诊断、预后和治疗监测。通过Simoa检测发现，在感染初期患痒病动物的血清中Nfl含量中位数比正常对照高15倍以上，而出现临床症状的痒病病羊血清Nfl含量与无症状病羊无显著差异[11]，提示可在痒病临床症状出现前利用Simoa技术检测活体动物血清Nfl水平，提高对痒病早期检测的能力，从而有望用于人类克雅氏症的诊断。

3 展望

3.1 开发个性化诊断试剂盒

基于Simoa技术和开放的用户设计研发平台（HD-1分析仪），利用实验室自制的抗体，可进一步开发超灵敏数字ELISA试剂盒，满足诊断需要。自制分析开发过程分为3个阶段：首先，制备一批捕获磁珠和生物素化检测试剂，要求磁珠浓缩液符合单体标准（＞75%的微珠为单体），并且初始运行的校准曲线达到所需的灵敏度水平；其次，在初次制备试剂盒满足目标要求的基础上，大批量制备试剂盒；最后，可进一步优化条件，提高磁珠偶联抗体的接合水平、抗体的生物素化水平，滴定分析试剂浓度，改变缓冲条件，或调整培养时间，以增加信号强度，降低背景干扰。降钙素原是全身炎症、细菌感染、败血症等多种临床症状的标志物。然而，在健康个体中，这种蛋白质的基线水平通常远低于当前ELISA的定量下限（LLoQ）。通过使用不同的偶联浓度固定捕获抗体，以及不同的生物素水平标记检测抗体，测试捕获和检测抗体的配置组合。通过优化SβG结合物的浓度，对测定方法进行微调。通过几周的时间，Simoa检测降钙素原的灵敏度比传统ELISA提高了100倍。在未来，研究人员可在几天之内利用全自动HD-1分析仪将现有的ELISA转换为更高灵敏度的Simoa技术，并可根据自身检测目的开发单一、多重病种的Simoa诊断方法。

3.2 开发便携式POC现场诊断套装

对于一些慢性疾病和潜伏期较长的疾病，需要提高诊断的灵敏性，提高基层一线对疾病的早期发现能力。如在区分活动性肺结核和潜伏感染时，利用Simoa技术检测白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-18（IL-18）和血管内皮生长因子（VEGF）4种宿主血液蛋白，并同时检测抗结核抗原Ag85B的抗体，从而提高了诊断方法的灵敏性和特异性[12]，使得检测感染潜伏期中特定生物标志物的细微变化成为可能，做到“一落叶而知秋”。同时，Simoa技术也可以动态监测传染病感染过程及疫苗免疫后宿主的反应和变化。目前配套的全自动HD-1分析仪体积较大，无法满足现场和基层的需求。未来应对设备进一步改造，使仪器“变小”“变轻”，结合相应的Simoa诊断策略，开发便携式POC诊断套装，实现传染病早发现、早诊断、早干预的目标。

4 结语

相比传统ELISA，Simoa技术的优势在于将现有检测的灵敏度提高约1 000倍，使以前难以或不可能测量的生物标记物的检测和量化成为可能，从而开辟了新的应用领域，以解决生命科学研究、生物制药和体外诊断领域尚未满足的重大需求。目前，该技术在一些重大传染病如新冠肺炎、结核病、艾滋病、痒病中的诊断优势已逐渐凸显。未来，在疫病防控领域，通过优化设备，降低检测成本，开发相关病种的试剂盒，有望利用Simoa技术提高疫病的综合诊断能力，实现“早发现、早诊断、早干预”的目标。此外，还可将该技术应用于疫苗免疫后的评价，为疫病防控提供参考和依据。