四川省石渠县牦牛棘球蚴病血清流行病学初步调查

张朝辉，华瑞其，徐 林，陈和强，杨光友

（1.甘孜藏族自治州动物疫病预防控制中心，四川康定 626000；2.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130）

棘球蚴病（echinococcosis）俗称包虫病，是由带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）绦虫幼虫——棘球蚴寄生于肝、肺等器官所引起的重要人兽共患寄生虫病，属于世界卫生组织（WHO）通报的被忽视的热带病和我国优先防治的二类动物疫病[1]。棘球蚴病主要流行于我国新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、青海、西藏以及四川等7 个省（自治区），对当地居民的生命健康和畜牧养殖业发展造成了极大威胁与阻碍[2]。石渠县位于四川省甘孜藏族自治州西北部，地处青藏高原东南缘川、藏、青3 省区结合处，全县平均海拔4 000 m，幅员面积25 191 km2，下辖23 个乡镇，总人口9.79 万。全国棘球蚴病抽样调查[3]显示，石渠县是我国棘球蚴病流行程度最严重的地区之一。据调查[4]，2017 年该县人棘球蚴病患病率为5.96%（5 036/84 742），占四川省棘球蚴病推测患者总数的18.05%（5 036/27 890）。

石渠县同时也是四川省海拔最高的牧业大县，畜牧养殖业是当地重要的支柱产业和居民收入来源。牦牛为石渠县重要的养殖动物，2017 年底存栏量约为47.63 万头。细粒棘球绦虫在当地广泛流行，是引起牦牛感染棘球蚴的主要致病原。其成虫寄生于犬科动物小肠，虫卵或孕卵节片随粪便排出而污染环境，牦牛因误食虫卵而感染[5]。棘球蚴感染牦牛后主要在肝脏或肺脏内形成包囊，影响牦牛生长发育和生产性能，并进一步在当地传播，对藏族地区畜牧业发展和藏族同胞生命健康构成威胁[6]。为了解石渠县牦牛棘球蚴病流行状况，2017年按照便利采样原则，在石渠县采集牦牛血清，采用ELISA 试剂盒检测棘球蚴抗体，以初步探究石渠县牦牛棘球蚴病的血清流行病学特征，并为当地牦牛棘球蚴病防控提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

本次调查以石渠县所辖的12 个乡5 个镇作为调查点，共采集牦牛血清2 047 份。其中：平均海拔4 000 m 及以下的9 个乡镇，共计抽样1 025 份；4 000 m 以上的8 个乡镇，抽样1 022 份。各乡镇作为独立采样单位，按照便利采样原则，对养殖户饲养的1 岁以上牦牛进行血清样品采集。每头牦牛采集血清后，独立编号并记录性别、年龄及所属乡镇。

1.2 主要仪器及试剂

恒温箱，型号DHP-9272，上海齐欣科学仪器有限公司；微量移液器，型号Finnpipette F2，Thermo Fisher Scientific，USA；酶 标 仪，型 号Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific，USA；振荡器，型号ZW-A，金坛市富华仪器有限公司；牛羊包虫病抗体EILSA 检测试剂盒，批号20170524，深圳康百得生物科技有限公司。

1.3 检测方法

血清学检测在四川农业大学动物寄生虫病研究中心进行。利用牛羊包虫病抗体ELISA 检测试剂盒进行抗体检测，检测程序及结果判定标准严格参照试剂盒说明书。在酶标板中，样品孔每孔加入50 μL 待检样品，空白对照、阴性对照及阳性对照均2 孔，每孔分别对应加入PBS 缓冲液、阴性血清及阳性血清各50 μL。除空白对照孔外，其余每孔加酶标结合物100 μL，盖好封板膜，37 ℃避光反应30 min；每孔加100 μL 显色液，盖好封板膜，37 ℃避光反应10 min；每孔加终止液50 μL，以空白对照调零，用酶标仪于450 nm 波长（630 nm 作为参比波长）读取OD 值。参考值：Cut-off 值=阴性对照OD×2.1（阴性对照孔OD ＜0.1 时，按0.1计）。有效性判定：阴性对照孔OD ≤0.20（若＞0.20，则试验无效），阳性对照孔OD ≥0.3（若＜0.3，则试验无效）。结果判定：样品OD≥Cut-off值，判为棘球蚴抗体阳性，反之为阴性。

1.4 统计方法

采用Microsoft Excel 2013 软件建立数据库，对数据经检查、核实、剔除后，通过SPSS 22.0 软件进行数据统计分析。计数资料采用χ2检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 总体检测情况

本次调查在石渠县共计检测血清2 047 份，检出阳性363 份，血清阳性率为17.73%（363/2 047）。具体结果见表1。

表1 石渠县各乡镇牦牛棘球蚴病血清抗体检测结果

2.2 地理分布

本次共调查了石渠县17 个乡镇，其中色须镇和格孟乡未检出阳性，而瓦须乡和温波镇血清阳性率较高，分别为51.89%（55/106）和63.89%（69/108），不同乡镇间血清抗体阳性率差异均有统计学意义（χ2=412.39，P＜0.05）。不同乡镇的血清阳性率地理分布结果（图1）显示：处于西北方向乡镇的阳性率（7.37%，82/1 112），与东南方向乡镇（30.05%，281/935）差异有统计学意义（χ2=179.08，P＜0.05）；处于海拔4 000 m 及以下乡镇的血清阳性率（29.85%，306/1 025），与4 000 m 以上乡镇（5.58%，57/1 022）差异有统计学意义（χ2=206.76，P＜0.05）。

图1 石渠县各乡镇牦牛棘球蚴血清流行率地理分布

2.3 群间分布

2.3.1 性别分布 本次调查共检测母畜814 头、公畜1 233 头，其中母畜和公畜棘球蚴血清抗体阳性率分别为15.72%（128/814）和19.05%（235/1 233），差异无统计学意义（χ2=3.74，P＞0.05），结果见表2。

表2 不同性别牦牛棘球蚴血清抗体检测统计结果

2.3.2 年龄分布 本次调查的牦牛均为1 岁及以上年龄，平均4.73 岁，其中最大的16 岁。不同年龄牦牛均有阳性血清被检出，年龄差异具有统计学意义（χ2=20.33，P＜0.05）；将牦牛年龄段分为1～2 岁幼年期与3 岁及以上成年期进行统计发现，幼年期牦牛血清阳性率（9.29%，13/140）与成年期（18.35%，350/1 907）差异有统计学意义（χ2=7.35，P＜0.05）。具体结果见表3～4。

表3 不同年龄牦牛棘球蚴血清抗体检测结果

表4 不同年龄段牦牛棘球蚴血清抗体检测统计结果

3 讨论

既往棘球蚴病防控经验表明，在棘球蚴病高度流行地区具有流行病学阈值效应和延迟效应特征，即当地犬棘球蚴感染率低于一定阈值并持续一段时间后，当地中间宿主棘球蚴感染率才可能随之降低[7]。如1997—1998 年，石渠县和甘孜县犬棘球绦虫平均感染率均为30.19%，而同期两县牦牛棘球蚴平均感染率分别为54.5%和49.7%[8]；到2012 年，石渠县和甘孜县犬棘球绦虫感染率分别下降至4.06%和0.63%，而两县牦牛棘球蚴感染率，石渠县仍维持在51.40%，甘孜县则下降至13.40%[9]。造成这种现象的原因可能是，甘孜县犬棘球绦虫感染率已低于阈值，而石渠县犬感染率未下降至阈值或牦牛感染率仍受延迟效应影响。通过近年来棘球蚴病防治项目的实施，2015 年石渠县家犬及野犬棘球绦虫感染率已分别下降至0.95%和2.09%[10]，说明通过长年实施棘球蚴病防治措施能显著抑制犬棘球绦虫感染，但并不能彻底避免犬感染棘球绦虫及控制棘球蚴病的传播。本研究于2017 年对石渠县牦牛进行棘球蚴血清流行病学初步调查，由于石渠县牦牛养殖户分布分散，样本采集难以按照流行病学理论中的采样策略进行系统采样，样本采集量也较少。但本次采样的范围较广，基本覆盖了整个石渠县，因此检测结果能够初步反映出当地牦牛棘球蚴病流行状况。本次流行病学调查发现，石渠县牦牛棘球蚴血清抗体阳性率为17.73%，低于2012 年的51.40%[9]，说明有一定的防控效果；但高于2016 年四川省牦牛平均棘球蚴感染率（5.41%）[11]，提示石渠县牦牛棘球蚴感染率可能已不再受延迟效应影响，说明当地牦牛棘球蚴感染仍较为严重。石渠县年均气温低，气候湿润，草场植被低矮，其自然生态环境十分利于虫卵的长期存活；此外，石渠县居民以藏族为主并且犬在当地大量存在，藏民往往将犬和牦牛同时放养，这无疑会增加牦牛摄入犬粪中虫卵的概率；加之当地缺乏规范化屠宰场，牦牛屠宰多在家庭或露天屠宰场进行，随后藏民会将有病变的牦牛内脏任意丢弃或直接喂食犬，从而又进一步促进了细粒棘球绦虫完整生活史的建立，从而造成当地牦牛棘球蚴感染率较高[12]。

棘球蚴病的流行往往具有地域分布特点。四川省是我国棘球蚴病流行最严重的地区之一，而位于青藏高原的石渠县又是四川省棘球蚴病流行情况最严重的地区[12-14]。本次调查发现，石渠县17 个乡镇的牦牛棘球蚴血清抗体阳性率存在差异，呈现东南方向低海拔（4 000 m 及以下）乡镇牦牛具有更高感染率的空间聚集性分布特征，提示牦牛棘球蚴病在当地具有地域分布差异。除格孟乡和色须镇（海拔均高于4 000 m）未检测到阳性血清外，其余15 个乡镇均检测到了阳性血清，而以瓦须乡和温波镇（海拔均低于4 000 m）血清阳性率较高，分别为51.89%和63.89%。石渠县平均海拔4 000 m，其中海拔处于4 000 m 以上乡镇的牦牛血清阳性率（5.58%）显著低于4 000 m 及以下乡镇（29.85%）。这可能是随着海拔升高，自然环境因素发生改变以及犬等终末宿主活动减少有关。在海拔高于4 000 m的乡镇中，呷依乡牦牛棘球蚴病血清阳性率仍较高，这可能与其地理位置最接近青海省（棘球蚴病高度流行地区）有关；尼呷镇犬分布相对集中且数量较多，这可能是该镇牦牛血清阳性率较高的原因之一。

在棘球蚴病的流行环节中，牦牛是重要的中间宿主，在棘球蚴病的传播过程中起着重要作用。我国是养殖牦牛数量较多的国家，占全球牦牛总数量的90%，年存栏约1 400 万头，其中四川省存栏约310 万头[15]。本次共调查石渠县公牦牛1 233 头和母牦牛814 头，其血清阳性率分别为19.05%和15.72%，但统计分析发现性别不是牦牛感染的影响因素。1～16 岁龄牦牛中均检出棘球蚴阳性血清，且年龄差异具有统计学意义，幼年牦牛血清阳性率（9.29%）显著低于成年牦牛（18.35%）。这可能是因为幼年牦牛接触虫卵的概率较少或感染后形成的包囊仍处于早期生长阶段。

对石渠县人感染棘球蚴的影响因素进行多因素logistic 回归分析发现，家中喂养牛羊和犬均是引起当地居民患棘球蚴病的危险因素[16]。而对石渠县棘球蚴病流行影响因素分析发现，户均羊数每增加1 只，人群患病率增加0.183 倍；而户均牛数每增加1 头，人群患病率则会增加0.274 倍[17]。此外，有调查[18]发现，青藏高原地区部分乡镇仅饲养了犬和牦牛，但仍然出现人棘球蚴感染病例，提示在今后防控工作中应把牦牛棘球蚴病防控作为研究重点。接种疫苗是预防中间宿主感染棘球蚴的重要手段，目前最为有效的疫苗为EG95 疫苗。临床和田间试验均表明，为棘球蚴病主要中间宿主（绵羊、山羊及牛）接种EG95 疫苗，均能使其获得良好的免疫保护效果[19]。随后，有学者对EG95 疫苗免疫牦牛的效果及安全性进行了评价，发现该疫苗接种不同地区的牦牛后均可使其产生较高的抗体水平并具有良好的安全性[20]。综上可见，除了对棘球蚴病流行区持续开展犬驱虫与管理以及绵羊强制免疫EG95 疫苗外，进行牦牛内脏无害化处理和对牦牛接种EG95 疫苗应考虑纳入未来棘球蚴病防控手段。

4 结论

经初步调查，石渠县牦牛群中仍有一定程度的棘球蚴感染，且呈现一定的区域和年龄分布特征，东南方向的低海拔区域以及高龄牦牛感染相对较严重。因此，石渠县应持续加强牦牛棘球蚴病防控和监测，将东南部的低海拔区域牦牛和高龄牦牛列为重点防控对象。