新型免疫佐剂碳纳米管的研究进展

彭何涛，李木子，宋翠平，赵肖璟，赵思俊

（1.宁夏大学，宁夏银川 750021；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

免疫佐剂（简称佐剂）能非特异性增强或改变机体对抗原的特异性免疫应答，目前常见的有矿物质佐剂、油佐剂、微生物佐剂、中草药佐剂、细胞因子佐剂等[1]。人医临床常见MF59和AS系列油佐剂，兽医临床常见铝胶佐剂、细胞因子佐剂和中草药佐剂等[2]。上述传统佐剂已被广泛应用于临床，并取得了较好的效果，但仍存在不良反应强等问题。因此，开展新型免疫佐剂研究对于提高机体免疫反应，获得较高的抗体水平，同时降低毒副作用具有重要意义。近年来，新型的纳米氢氧化铝、纳米磷酸钙、纳米金、壳聚糖、脂质体等佐剂被广泛关注[3-5]。纳米佐剂具有常规佐剂不可比拟的优势[6-7]：纳米粒子表面经修饰后，可成功引入具有靶向性的配体或靶向到特定细胞的其他成份，使携带的免疫原有效运输到相应的免疫细胞；纳米佐剂可提高免疫原稳定性，减少免疫原用量，延长作用时间，且自身不具备免疫原性。因此纳米佐剂是目前较为理想的免疫佐剂之一。

纳米材料与传统宏观材料相比，具有较为特殊的物理化学表征，因而在生物医药、航空航天、资源环境等领域具有巨大的应用价值[8-9]。碳纳米管作为一类重要的新型纳米材料，具有最简单的化学组成和原子结合形态，其尺度、结构、拓扑学因素以及和碳原子相结合的特性赋予了碳纳米管极为独特的性能，因而在力学、电学、磁学、光学、储氢、热学等方面具有优异的性能，成为近些年备受关注的纳米材料之一[6]。碳纳米管可以通过物理吸附或化学耦联等途径与多种物质连接，因而成为多种药物、基因、生物探针分子的新型载体[10]，可发挥良好的生物学效应。其中，碳纳米管可与具有免疫原性的物质相连接，直接进入吞噬细胞或网状内皮细胞[7]，诱发机体细胞免疫或体液免疫应答，产生特异性抗体，且碳纳米管本身不具有免疫原性[11]，因此可起到免疫佐剂作用。该效应的发现，引起科研工作者的兴趣并开展了深入研究。本文从碳纳米管的基本性质、结构修饰、免疫机理及实际应用等几方面综述了其发挥免疫佐剂特性的研究进展。

1 碳纳米管基本性质

碳纳米管是日本电镜专家Sumio Iijima于1991年通过高分辨率分析电镜，从电弧法生产的碳纤维中发现的一种新型碳晶体[12]。它由含有六边形网格状的石墨片层卷曲而成，形成无缝纳米管状晶体（图1）。根据其管壁层数可将其分为单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotube，SWCNT）和多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）。SWCNT由单层圆柱形石墨层构成，直径一般为0.4～2.5 nm，具有柔性和高度均一性特点；MWCNT根据制备条件不同而异，管壁层数从2～50层不等，直径最大可达100 nm。碳纳米管长度可在纳米至数百微米之间变化[13]。碳纳米管具有比表面积高[14]、化学稳定性好、非特异性吸附能力强[15]、可穿过生物膜但不破坏细胞结构等多种特性[16-17]。科研工作者利用这些优异的性能，在生物传感器、药物载体、肿瘤治疗等生物学领域开展了积极的探索和研究。研究发现，碳纳米管携带免疫原进入机体可激活补体系统[15]，促进吞噬细胞吞噬，增强机体免疫应答及提高特异性抗体水平[18-19]，这为免疫佐剂研发提供了新思路，从而引起了关注。

图1 碳纳米管结构示意图[13]

2 作为免疫佐剂的优势

碳纳米管结构中空多孔，又具有极高的比表面积，可以非特异性吸附多种药物、基因、蛋白质等物质[15，20]，特别是多壁碳纳米管在形成时，因管壁上通常布满小洞样的缺陷，层与层之间很容易形成陷阱中心而容纳更多的生物活性分子[14]。体外研究[21]发现，碳纳米管可与血浆中的多种蛋白发生非特异性吸附，且吸附过程不可逆。通过非共价键吸附蛋白等生物大分子于碳纳米管表面或管腔内[22-23]，也可提高碳纳米管的溶解性和生物相容性。这些方法可产生较为稳定的碳纳米管-免疫原复合物，为进入机体后发挥免疫佐剂作用提供了可靠保证。

然而，碳纳米管自身具有很强的疏水作用，难以溶于水和有机溶剂，在溶液中常以团聚形式存在，因而降低了其比表面积利用率，影响其吸附各类生物分子的能力[24]。研究者在其表面进行化学修饰，连接了数量不等的各类化学基团[25-27]，这样可以很好地改善碳纳米管表面特性，增强其水溶性和组织相容性，更重要的是通过化学修饰可定向引入免疫原分子，形成稳定的免疫原-碳纳米管复合物，并突出免疫原的特征位点，更有利于获得特异性抗体。Parra等[28]利用羧基化、酸碱中和及氧化还原反应，将牛血清白蛋白-嘧菌酯半抗原（BSA-azoxystrobin）连接至多壁和单壁碳纳米管上，成功制备了针对嘧菌酯半抗原的免疫复合物，获得了良好的免疫效果。除化学修饰外，依靠物理修饰，如在溶液中添加聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），十二烷基硫酸钠（SDS）、TritonX-100等化学试剂[29]，也可增强碳纳米管的分散性、溶解性和渗透性。

研究[10]发现，碳纳米管可以进入细胞，且不破坏细胞膜结构，从而为抗原运输和递送提供了有利条件。而碳纳米管进入免疫相关细胞是其作为免疫佐剂研究关注的重点。吞噬细胞表面表达模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）与病原生物表面的病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）相 互 识别、作用，这一过程是启动先天性免疫应答的关键。Pondman等[11]报道了多种模式识别受体都具备识别纳米颗粒的潜力，纳米物质一旦结合至受体上，将会被吞噬细胞吞噬和清除。Meng等[30]采取经小鼠背部皮下注射多壁纳米管方式，也观察到了巨噬细胞吞噬碳纳米管的现象。除吞噬作用（phagocytosis）外，碳纳米管还可通过内吞作用（endocytosis）和跨细胞膜途径直接进入吞噬细胞内，且细胞膜均能保持完好。Kam等[31]通过体外试验发现，短的单壁碳纳米管（长度为50～200 nm）可通过网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞。Pantarotto等[32]研究表明，稍长的单壁碳纳米管（长度为300～1 000 nm）在进入人和小鼠的成纤维细胞时表现出直接作用细胞膜的跨细胞行为。对碳纳米管进行功能化修饰，可影响碳纳米管与吞噬细胞的作用，如亲水性或酸性聚合物包覆的多壁碳纳米管比疏水性聚合物包覆的可更有效被巨噬细胞内吞[11]；经过聚乙二醇修饰的单壁碳纳米管可穿透细胞膜进入宿主细胞，且不影响细胞生长。碳纳米管进入细胞后，可以在细胞质、内质体中观察到。也有在细胞核内观察到的报道[11]。

3 应用及作用机制

Pantarotto等[18]于2003年首次证实氨基化单壁碳纳米管可显著提高抗口蹄疫病毒VP1肽段中和抗体的表达水平，且未检测到机体产生针对碳纳米管的特异性抗体，表明碳纳米管具备免疫佐剂的特性。随后多位科研工作者先后开展了有关碳纳米管作用机体免疫应答的研究，并取得了一定进展。Pimentel等[33]发现，抗牛厌氧芽孢杆菌合成肽（Am1）与多壁碳纳米管形成的纳米复合物免疫后可显著提高宿主抗Am1的IgG水平。Jia等[34]报道了单壁碳纳米管可显著提升大嘴鲈鱼溃疡综合征病毒主要衣壳蛋白（MCP）制成的亚单位疫苗的免疫保护效率。邢杰等[35-36]通过体内及体外试验发现，香菇多糖修饰的碳纳米管可调节并提高机体免疫功能，增强免疫效果。有研究者证实，多壁碳纳米管提高机体免疫应答的能力与弗氏佐剂相当[37]。与常规的肿瘤免疫治疗相比，多壁碳纳米管偶联肿瘤相关蛋白进入机体可更有效促进抗肿瘤免疫的发生[7]，这为肿瘤免疫治疗提供了思路。除大分子物质外，Parra等[28]还报道了羧基碳纳米管能够大大提升半抗原的抗体效价，同时还显著降低免疫原剂量，有效节约成本。此外，单壁碳纳米管还能延长DNA疫苗在体内的保留时间，并提高其表达水平，诱导更强的免疫应答[38]。有研究者将碳纳米管当作人工抗原递呈细胞（artificial antigen-presenting cells），功能化的单壁碳纳米管可绑定并递呈高浓度T细胞共刺激分子，如抗CD3分子和MHCⅠ类分子，随后T细胞免疫应答被激活[7]。

目前，碳纳米管增强机体免疫应答的确切作用机制尚未揭示。有研究者发现，皮下注射碳纳米管可激活补体系统，改变碳纳米管表面特性可增加或降低补体系统活化程度[39-41]，而不同的表面修饰可以将补体激活从一种途径切换到另一种途径[11]。碳纳米管可影响抗原引起的免疫应答，调控Th细胞分化，主要诱导以体液免疫为主的Th2型免疫反应。但也有少量关于引起Th1型免疫反应的报道[42]。另外，Kagan等[43]通过体外和体内试验发现，碳纳米管通过与免疫细胞相互作用，激活核转录因子NF-κB和AP-1，从而增强氧化应激和细胞因子释放，激活T细胞。经皮下注射的碳纳米管蓄积于皮下组织，引起大量巨噬细胞对其吞噬，而吞噬了碳纳米管的巨噬细胞随循环系统迁移到淋巴结内，但未在心、肝、脾、肾等脏器中观察到碳纳米管蓄积，也未发现长期炎症反应及明显组织病变[30]，因而认为皮下注射是现阶段碳纳米管用于疫苗佐剂的最佳免疫途径。

4 存在问题

碳纳米管具有多种优良特性，其在基因、药物和疫苗等生物分子的运载方面具有极大的应用潜力，被科研工作者称为“纳米注射器”[7]。随着对碳纳米管生物学效应研究的深入，其毒理学特征也成为人们关注的焦点[7]。多位研究者发现，通过不同途径（呼吸道灌注、静脉注射、腹腔注射、皮下注射）进入机体的碳纳米管可出现在不同组织脏器中，并引起炎症反应，其中经呼吸道途径进入体内，可引起肺部组织肿瘤的发生[44-45]。Manna等[46]发现，碳纳米管进入气管后会造成肺部强烈的炎症反应。多壁碳纳米管经气管进入大鼠体内，会逐渐跨过气血屏障，在肝脏、肾脏和脾脏中蓄积[47]。静脉注射碳纳米管，导致碳纳米管持续在脾脏、肺脏、肝脏中蓄积，而蓄积的碳纳米管可引起细胞的氧化应激和凋亡[48]。也有大量数据显示，碳纳米管对机体的毒性与其结构、使用剂量、功能化修饰和给药途径有关。如：单壁碳纳米管毒性显著低于多壁碳纳米管[49]；羟基化修饰的多壁碳纳米管，对人肝癌细胞和人结肠癌细胞的毒性显著低于不经修饰的多壁碳纳米管[50]；功能化修饰后具有水溶性的碳纳米管，可随血液循环经过尿液排出，不产生蓄积和毒性作用[50]。由此可见，对碳纳米管进行功能化修饰是解决碳纳米管相关毒性效应的关键。

5 展望

碳纳米管作为免疫佐剂方面的研究表明，其能发挥良好的佐剂效果，减少免疫原剂量，通过皮下免疫途径可降低炎症等不良反应，是优良的候选佐剂之一。下一步，需对碳纳米管最佳的功能化修饰方式、最适的免疫剂量及免疫毒性三方面进行深入研究，相信其结果的揭示，将为纳米材料免疫佐剂的开发和应用带来巨大的科研价值和广阔的发展空间。