贮藏模式对脂肪结晶O/W乳液的结晶行为与宏观性能影响

焦文娟，李冰，李琳，昝胜杰，苏爽，陈智毅，张霞

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东广州 510640）

（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

食用脂肪是人体必需的三大营养物质之一，在人类健康中发挥着重要作用。然而，脂肪的密度高且饱腹感弱容易导致过度摄入，这通常被认为是导致肥胖、心血管疾病和癌症的主要原因之一[1]。脂肪摄入之后，需要经过消化才能被人体吸收，在高摄入的趋势下，有效地调控脂肪的消化性能是降低其体内吸收的有效途径[2-4]。而脂肪的物理状态及晶体结构与其消化性能密切相关，因此，为了进一步明晰脂肪晶体的胃肠消化特性，对健康脂肪制品的生产进行指导，本论文首先构建具有不同的脂肪结晶结构的乳液体系。

乳液体系成为食品工业的重要体系，许多高脂食品（冰淇淋、人造奶油、黄油、巧克力等）都是以结晶乳液的形成存在的，结晶乳液中的脂肪晶体三维网络结构会严重影响产品的口感、机械特性（质地、硬度和铺展性等）、外观和营养特性等[2,5,6]。脂肪晶体网络的形成受很多因素的影响，甘油三酯（Triglycerides，TAG）中脂肪酸的链长、饱和程度及脂肪酸在TAG中的位置分布都会影响脂肪结晶。除TAG的本身因素影响以外，加工条件（冷却速率、剪切速率）、贮藏条件（贮藏温度及时间）也会影响脂肪晶体网络的形成及特性（SFC、脂肪晶体尺寸、晶型和位置分布）[2,5,7,8]。快速冷却有利于形成α晶体和大量的小的晶体，而较慢速冷却促进β’和β晶型的形成和少量的较大晶体，贮藏阶段（温度和时间）会影响晶体的成核及生长过程，将决定晶体的最终尺寸[2,5,7,8]。

在我国，棕榈油消费量每年约为600万t，占市场总量的20%。棕榈硬脂是以棕榈油为原料进一步分提制备出的，进口量占棕榈油总量的20%[8]，在食品工业中有着广泛的应用，主要用于制备人造奶油、起酥油和糖果专用油脂等[9]。棕榈硬脂熔点一般为44 ℃～56 ℃，常温下呈现半固体状。因此，本论文选择食品工业中常见的高熔点棕榈硬脂作为研究对象，对不同贮藏模式下脂肪结晶乳液的结晶行为及宏观性能进行研究，为进一步研究脂肪结晶结构调控消化行为奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棕榈硬脂（熔点50 ℃、碘值30.48 g I/100 g油、酸价0.39 mg KOH/g游离脂肪酸、过氧化值0.65 mmol/kg），食品级，购于益海嘉里投资有限责任公司；酪蛋白酸钠，分析纯，购于Sigma-Aldrich（上海）公司；去离子水，分析纯，购于广州丛源仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

BS224S电子分析天平，德国Sartorius公司；Q-100低温恒温水浴循环器，中国宁波新芝仪器厂；Smartlab X-射线衍射仪，日本Rigaku公司；MS-H-Pro+磁力搅拌器，中国DragonLab公司；T18高速剪切乳化机套装，德国IKA公司；VCX500超声细胞破碎仪，美国SONICS公司；mq-one固体脂肪分析仪，德国Bruker公司；DHR-2流变仪，美国TA公司；DSC 8000差示扫描量热仪，美国PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 结晶乳液的制备

乳液由（30 wt.%）油相和（70 wt.%）连续相组成，乳液总量为100 g。其中，连续相为酪蛋白酸钠溶液，油相为采用棕榈硬脂。酪蛋白钠与蒸馏水在60 ℃恒温磁力搅拌至少2 h，乳化剂浓度为1 wt.%（以最终乳液总重计）。在制备乳液前，棕榈硬脂在80 ℃加热30 min，消除结晶记忆，水相与油相混合后在60 ℃恒温30 min，用高速剪切乳化机套装在13000 r/min均质2 min，用超声细胞破碎仪在200 W功率超声30 s（工作10 s间隔10 s），最后将制备好的乳液取20 mL分装在血清瓶中。两种贮藏模式，恒温贮藏：在4 ℃、25 ℃、37 ℃中，分别贮藏6 h，分别标记为恒温（4 ℃）、恒温（25 ℃）、恒温（37 ℃）；温度波动贮藏：先在37 ℃贮藏1 h，然后转移至4 ℃分别贮藏6 h，标记为温度波动（37 ℃～4 ℃）。贮藏之后用于乳液的各项性质分析。

1.3.2 热性质测定

采用差示扫描量热仪（Differential scanning calorimeter，DSC）测定纯油和结晶乳液的熔化结晶曲线，纯油的贮藏方式与乳液保持一致（参考1.3.1）。称取6 mg纯油或20 mg乳液样品置于高压盘中，为了保持与贮藏最终温度一致，样品分别在4 ℃、25 ℃和37 ℃平衡2 min，之后以5 ℃/min加热到80 ℃获得纯油和乳液的熔化曲线，并根据DSC软件计算焓值。

1.3.3 固体脂肪含量的测定

采用固体脂肪分析仪测定纯油的固体脂肪含量。将纯油在80 ℃融化30 min，消除结晶记忆，之后取3 g加入核磁管中。纯油的贮藏方式与乳液保持一致（参考1.3.1）。SFC的测定参考AOCS Cd 16b-93[10]。测定之前，仪器采用三种标准SFC（0%、31.3%、74.6%）进行连续校准。然后，将玻璃核磁管放入p-NMR分析仪中，读取SFC值。每个样品重复测定三次，取平均值。乳液的固体脂肪含量（SFCemulsion）的测定根据以下方程：

其中，ΔHm-emulsion和ΔHm-bulk分别代表乳液和纯油熔化峰的焓值[11]；SFCfat是指纯油的固脂含量。

1.3.4 X射线衍射（XRD）测定

采用X射线衍射法测定乳液中脂肪晶体的同质多晶现象，并根据峰面积计算相对含量。使用具有Ni过滤器的Cu-KR辐射（电压40 kV；电流40 mA），分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃下以2.0 °/min从5至30 °（2θ）扫描样品。另外，β和β’晶体的相对含量（%）使用以下方程计算[12]：

其中，Aβ和Aβ′分别是β和β’晶型的峰面积。

1.3.5 乳液乳析指数的测定

取8 mL乳液加入10 mL透明试管中，分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃贮藏6 h，以及先在37 ℃贮藏1 h，再放置4 ℃分别贮藏6 h。贮藏后分别测定乳液总高度H0及乳清液高度H，乳液的乳析指数（creaming index，CI）的计算如下：

1.3.6 晶体形态观察分析

采用偏光显微镜对乳液（光学模式）及晶体（偏光模式）的微观结构进行观察。在室温下，取适量样品置于载玻片上，用镊子将盖玻片盖在样品上并避免气泡的产生，使用连接Canon数码相机的偏光显微镜观察乳液及晶体的微观形态，并拍照片记录，放大倍数为500。

1.3.7 乳液表观粘度的测定

采用流变仪对乳液的表观粘度进行测定，采用不锈钢平行板（直径为40 mm）和稳态剪切实验模式，测量温度与最终贮藏温度保持一致，样品台分别提前预热至4 ℃、25 ℃、37 ℃。量取2 mL样品置于流变仪的高台上，剪切速率由0.01 s-1升至100 s-1。

1.4 数据处理及分析方法

实验结果表示为平均值±标准差，使用SPSS软件Duncan’s进行方差分析，p＜0.05表明存在显著性差异。

2 实验结果与讨论

2.1 脂肪结晶O/W乳液的固脂含量（SFC）

SFC值是判断脂肪产品物理化学性质的一个重要指标，反应在一定温度下固体脂肪晶体的含量[13]。SFC值与脂肪晶体性质、预热过程及结晶速率密切相关，温度是影响SFC值的一个重要因素，同种脂肪在不同的温度下会呈现出不同的SFC值[14]。为了测定结晶乳液的SFC值，首先对经过恒温（分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃贮藏6 h）及温度波动（先在37 ℃贮藏1 h，然后分别在4 ℃贮藏6 h）贮藏后的纯油和脂肪结晶O/W乳液的基本热性质（焓值）进行测定，其结果见图1和表1。

表1 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的纯油和脂肪结晶O/W乳液的焓值和SFCTable 1 Enthalpy (ΔHm) and SFC of crystalline emulsions and bulk fats after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

图1 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏6 h的纯油和脂肪结晶O/W乳液的熔化曲线Fig.1 Melting profile of crystalline O/W emulsions and bulk after 6 h of constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

差示扫描量热法（DSC）是研究纯油体系和乳液体系中脂肪相变热力学的常见的方法，油脂的物理状态变化（熔化、结晶等）或晶型转变都伴随着热量的吸收（吸热）或释放（放热），根据计算峰面积可以得到焓值[8]。纯油和脂肪结晶乳液的DSC的测定结果如图1所示。由图1可知，经过恒温（分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃贮藏6 h）和温度波动（先在37 ℃贮藏1 h，然后在4 ℃贮藏6 h）贮藏后的纯油的熔化曲线略有不同。其中，在恒温（4 ℃和25 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的纯油具有两个熔化峰，而恒温（37 ℃）贮藏的纯油只有一个熔化峰，这是由于不同晶型的脂肪晶体（β’和β）呈现出不同的熔化峰，且β’晶型的熔点低于β晶型[15]。对于脂肪结晶O/W乳液而言，所有样品只含有一个熔化峰，且峰宽小于纯油体系，这可能是由于在乳液和纯油体系中成核机理的不同（乳液中的均相成核与纯油中的异相成核）[16,17]。

表1 表明了纯油与结晶乳液的SFC值，由表1可知，对于恒温贮藏模式而言，纯油和乳液的SFC值随着贮藏温度的升高显著降低（p＜0.05），其中，恒温（4 ℃）贮藏的纯油和乳液的SFC值分别为74.42%和28.31%。在相同的贮藏温度下，纯油的SFC值高于乳液的SFC值，且贮藏温度低更易形成SFC高的脂肪结晶乳液[16,17]。而对于结晶乳液而言，恒温（4 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏乳液的SFC值类似（28%）（p＞0.05），尽管贮藏起始温度（37 ℃和4 ℃）不同，但最终都在相同的温度（4 ℃）进行贮藏，也就是冷却速率不同，快速冷却易形成较高的SFC的脂肪结晶乳液，而缓慢冷却导致较低的SFC脂肪结晶乳液，随后的储藏温度和时间将决定晶体的最终尺寸[2,5,7,8]，最后的SFC值类似。

2.2 脂肪结晶O/W乳液的晶型

X射线衍射用于提供脂肪晶型的基本信息，短间距（高角度衍射）用于确定晶型及含量[8]。经过恒温（分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃贮藏6 h）及温度波动（先在37 ℃贮藏1 h，然后在4 ℃贮藏6 h）贮藏后的脂肪结晶O/W乳液的短间距图谱如2所示。由图2可知，样品在短间距值为5.18、4.59、4.58、4.54、4.46、4.33、4.31、4.22、4.21、4.19、3.89、3.88、3.87、3.83、3.76及3.64 Å处出现衍射峰。已有研究表明，β晶型在4.6 Å出现强衍射峰，β’晶型的特征峰是在4.2 Å和3.88 Å处左右出现的双衍射峰[15,18,19]。由图2可知，所有脂肪结晶O/W乳液同时存在β’和β晶型的特征峰，且在恒温（4 ℃）和温度波动（先37 ℃然后4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液中β’晶型的特征峰较明显，而在恒温（25 ℃和37 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液β晶型特征峰更明显。为了进一步量化经过贮藏后脂肪结晶O/W乳液的晶型含量的变化，采用peakfit软件对其进行拟合处理，β和β’晶型的含量如表2所示。

图2 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的结晶O/W乳液的XRD曲线Fig.2 XRD spectra of crystalline O/W emulsions after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

由表2可知，对于恒温贮藏的脂肪结晶乳液，β晶型含量依次按恒温（37 ℃）、恒温（25 ℃）、恒温（4 ℃）依次显著降低（p＜0.05），且在恒温（4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液中只含有少量的β晶型（2.32%）。同时，温度波动（先37 ℃然后4 ℃）贮藏的乳液的β晶型含量显著高于恒温（4 ℃）贮藏乳液的β晶型含量（p＜0.05）。这是由于在高温贮藏时，β’晶型更易转变成更稳定的β晶型所致，样品中低熔点的TAG晶体融化，高熔点的TAG容易聚集形成更大更多的β晶型。

表2 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的晶体含量Table 2 Crystal content of casein sodium salt-stabilized emulsions after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

2.3 脂肪结晶O/W乳液形态及晶体形态观察

采用偏光显微镜（自然光及偏光模式）对经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏6 h的乳液及晶体形态进行观察，结果如图3。乳液属于热力学不稳定体系，油-水界面具有较高的界面能，随着时间的推移，会出现乳液去稳定现象[20]。从图3可知，在光学模式下观察发现，结晶O/W乳液脂滴之间由于范德华力的吸引作用出现了不同程度的絮凝现象，对于在恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液而言，随着贮藏温度的升高，乳液脂滴之间的絮凝程度逐渐严重，说明结晶乳液随着贮藏温度的增加，去稳定现象更加明显。从XRD的结果可知，对于恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液而言，在相同贮藏时间下，β晶型的含量按恒温（37 ℃）、恒温（25 ℃）、恒温（4 ℃）依次降低，且在恒温（4 ℃）贮藏的乳液只含有少量的β晶型。对于恒温（4 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的结晶乳液而言，温度波动贮藏模式首先在37 ℃进行贮藏，形成的结晶乳液中脂肪晶体颗粒相对较大[16,17]。根据β’晶型易形成相对小的晶体颗粒和β晶型形成相对大的晶体颗粒[15]。结合偏光模式下观察可以发现，恒温（4 ℃）贮藏的脂肪结晶乳液的晶体颗粒最小，而恒温（37 ℃）贮藏的乳液的晶体颗粒相对较大。与恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）贮藏相比，在温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏下的脂肪结晶乳液中脂肪晶体颗粒相对较大。总体而言，结晶乳液中脂肪晶体尺寸按恒温（37 ℃）、恒温（25 ℃）、温度波动（37 ℃～4 ℃）、恒温（4 ℃）依次减小。

2.4 脂肪结晶O/W乳液的稳定性

乳液体系中油水界面具有较高的界面能，属于热力学不稳定体系，放置会出现乳液去稳定现象，去稳定机理有分层、絮凝、聚结、部分聚结和奥氏熟化[20]。乳析指数（CI值）是表征油相和连续相平衡状态的重要指标，是评价乳液物理稳定性的一个重要参数，可以间接反映乳液絮凝和聚集的程度，CI值越小，表明乳液越稳定[21]。经过恒温和温度波动贮藏后的脂肪结晶O/W乳液的CI值如表3所示。由表3可知，经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）及温度波动（37 ℃～4℃）贮藏后，脂肪结晶O/W乳液发生不同程度的分层。CI值按恒温（37 ℃）、温度波动（37 ℃～4 ℃）、恒温（25 ℃）、恒温（4 ℃）依次减小，表明恒温（4 ℃）贮藏的脂肪结晶乳液的稳定性最好，在恒温（37 ℃）贮藏后的脂肪结晶乳液的CI值（44.47%）最大，乳液分层最为严重，稳定性最差。乳液属于热力学不稳定体系，贮藏温度越高，越易导致乳液去稳定。经过光学显微镜（图3）观察可知，经过贮藏的乳液脂滴界面膜保持完整，且未有明显的大粒径脂滴的出现，则可推断引起乳液去稳定的主要原因为絮凝作用。

表3 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的CI值Table 3 The physicochemical properties of crystalline O/W emulsions after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

图3 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液及晶体微观形态观察Fig.3 Microstructure of crystalline O/W emulsions after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage(37 ℃ then 4 ℃)

2.5 脂肪结晶O/W乳液的表观粘度

乳液体系的粘度一般受油相组成、连续相组成、脂滴浓度以及脂滴之间的相互作用影响，且随着温度的变化而变化[22]。图4列出了经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）及温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的表观粘度。从图4可知，在设定的剪切速率范围（0.01～100 s-1）内，随着剪切速率增大，所有脂肪结晶O/W乳液的表观粘度不断降低，且恒温（4 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液，在低剪切速率（0.01～1 s-1）呈线性降低，在高剪切速率（1～100 s-1）下表观粘度趋于平衡，呈现剪切稀化的特性，属于假塑性流体；而恒温（25 ℃和37 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的表观粘度在整个阶段不断降低。在脂肪结晶乳液中表观粘度的下降是因为随着剪切应力的增加，絮凝结构（脂肪球聚集）发生形变乃至破碎，液滴定向排布阻力减小[22-24]。在整个剪切过程中，表观粘度按恒温（25 ℃）、恒温（37 ℃）、恒温（4 ℃）、温度波动（37 ℃～4 ℃）依次减小。在恒温（25 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的表观粘度最大，而在温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的乳液的表观粘度最小。当剪切速率为100 s-1时，恒温（25 ℃）、恒温（37 ℃）、恒温（4 ℃）、温度波动（37 ℃～4 ℃）的表观粘度分别为0.49 Pa·s、0.10 Pa·s、0.06 Pa·s、0.03 Pa·s。恒温（4 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏乳液的SFC类似，且SFC依次按恒温（25 ℃）、恒温（37 ℃）降低；恒温（37 ℃）贮藏的乳液中β晶型含量最高，而恒温（4 ℃）贮藏的乳液中β晶型含量最低，这表明表观粘度不仅与固体脂肪含量相关，还有脂肪晶体晶型及尺寸相关，但表观粘度随着SFC和β晶型含量的变化没有明显的趋势变化。

图4 经过恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）和温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的脂肪结晶O/W乳液的表观粘度Fig.4 Apparent viscosity of crystalline O/W emulsions after constant-temperature (4 ℃, 25 ℃, 37 ℃) and fluctuating-temperature storage (37 ℃ then 4 ℃)

3 结论

恒温（4 ℃、25 ℃、37 ℃）及温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏模式下脂肪结晶O/W乳液存在不同的结晶行为与宏观性能。对于恒温贮藏模式而言，恒温（4 ℃）贮藏的结晶乳液SFC值最高，β晶型含量最低，脂肪晶体颗粒相对较小，而恒温（37 ℃）贮藏的结晶乳液中SFC值最小，β晶型含量最高，脂肪晶体颗粒最大。恒温（4 ℃）与温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的结晶乳液的SFC值类似，但温度波动（37 ℃～4 ℃）贮藏的结晶乳液中的β晶型含量、脂肪晶体颗粒都大于恒温（4 ℃）贮藏的结晶乳液的。恒温（25 ℃）贮藏乳液的表观粘度值最大、而温度波动（37 ℃～4 ℃）的表观粘度值最小，但表观粘度在不同的贮藏模式下没有明显的变化趋势。低温贮藏易形成SFC高、脂肪晶体颗粒小的结晶乳液。通过恒温贮藏可以构建具有不同SFC及脂肪晶体结构的脂肪结晶乳液，恒温贮藏与温度波动贮藏结合可以构建具有相同SFC及不同脂肪晶体结构的脂肪结晶乳液。