金柚幼果膳食纤维改善糖尿病小鼠的肠道健康

黄妙如，宋海凤，陈子钧，胡悦，林琪欣，张浣悠，马路凯，刘袆帆

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510000）

在柚子种植中，有大量自然掉落的柚子幼果，该幼果皮厚肉少，销售价值大幅下降，造成经济损失与浪费。在之前的研究中[1]，提取了金柚幼果中的三种膳食纤维（dietary fiber，DF），分别是总膳食纤维（total dietary fiber，TDF）、可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）与不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）。对它们的结构和性质进行表征，研究发现三种膳食纤维的持水、持油和膨胀性均延缓了葡萄糖的扩散，抑制了α-淀粉酶的合成，影响了胆固醇胶束的形成。通过四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型，研究发现金柚幼果的三种膳食纤维均可改善血糖浓度、降低血脂水平，并有利于影响肠道菌群的丰富度和多样性。

糖尿病是危害人体健康的非传染性慢性疾病之一[2]。膳食纤维在营养学上被作为一种十分重要的营养素[3]。膳食纤维可以有效延缓消化[4]，对糖尿病患者调节胰岛素敏感性、改善胆固醇的排泄等有一定的作用[5]。相关研究表明，膳食纤维可以使肠道内容物体积增大和水分含量升高，充盈肠胃腔[6]。膳食纤维经过肠道微生物发酵产生短链脂肪酸，肠道内pH值降低可导致微生态环境的变化，改善有益菌的繁殖，同时抑制肠道有害菌群的生长[7,8]。

肠道菌群的各种反应在肠道健康中都起关键性的作用，工作良好的健康肠道是人体全面健康的基础和保障。因此，本研究以金柚幼果膳食纤维为样品，通过小鼠4周灌胃喂养，观察和检测小鼠肠道内环境健康相关指标的变化；以小鼠粪便中的16S rDNA基因为研究对象，通过高通量测序技术解读微生物群体的多样性、丰富度及群体结构，研究金柚幼果的膳食纤维对糖尿病小鼠肠道菌群的影响，进一步阐明肠道菌群在金柚幼果膳食纤维降糖效果中的作用，为金柚幼果膳食纤维改善肠道健康提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梅州沙田柚幼果，幼果为同一批次落果，个头大小相仿。

BN1680型四氧嘧啶，Bioswamp公司；戊巴比妥钠，Merck公司；耐高温α-淀粉酶（4000 U/g），纤维素酶（400 U/mg），木瓜蛋白酶（800 U/mg），上海瑞永生物科技有限公司；糖化酶，中性蛋白酶，河南万邦实业有限公司；P3761型戊巴比妥钠，Sigma Merck公司。

1.2 仪器与设备

360型血糖仪，鱼跃公司；J21070型手术直剪、WA3040型显微镊、WA1020型显微剪，金钟公司；ME203E/02电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-1D-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器公司；HY-200标准分样筛，金源筛网；BCD-192TGN冰箱，青岛海尔股份有限公司；L600离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHG-9023A恒温干燥箱，飞迪科技有限公司；HH-2s数显恒温水浴锅，金坛市科杰仪器厂；榨汁机、密封袋、保鲜纸、一次性培养皿、一次性手套，市售。

1.3 实验动物

雄性无特定病原体的昆明小鼠，六周龄，体重20.0 g±0.20 g，购于武汉华联科生物技术有限公司，许可证号：SYXK（鄂）2018-0104。

1.4 实验方法

1.4.1 金柚幼果的预处理

清洗柚子幼果，切成小于4 cm的小块，经鼓风干燥机完全干燥后（55 ℃，24 h），再粉碎样品转移到烧杯中，用封口膜密封并在-4 ℃条件下保存备用。

1.4.2 膳食纤维的提取

参考Liu等人的方法[1]，具体实验步骤如下：

1.4.2.1 总膳食纤维（TDF）制备

取10 g柚子粉置于250 mL锥形瓶中，以1:10的比例加入去离子水搅拌，微波振荡15 min，沸水浴糊化15 min，再次振荡后（50 ℃，30 min），依次加入耐高温α-淀粉酶（95 ℃，60 min）、糖化酶（60 ℃，60 min）、中性蛋白酶（55 ℃，120 min）进行酶解，最后沸水灭酶15 min，冷却，4倍无水乙醇处理，过夜放置，抽滤，冻干，得总膳食纤维。

1.4.2.2 水溶性膳食纤维（SDF）制备取10 g柚子粉，加入20 mL乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，在沸水浴中煮沸1 h，冷却，加入0.03%（体积分数）纤维素酶，50 ℃条件下酶解1.5 h。加热混合物到85 ℃，10 min灭酶，再加入0.06%木瓜蛋白酶在60 ℃酶解30 min，冷却，4倍95%乙醇处理，过夜放置。

1.4.2.3 不水溶性膳食纤维（IDF）制备

取10 g柚子粉，以1:10的比例加入去离子水进行溶解，离心分离（1500×g，15 min）后取沉淀，进行酶法处理（α-淀粉酶，温度70 ℃，pH 5.5，加酶量0.6%，时间80 min），继而过滤，取滤渣烘干，得水不溶性膳食纤维。

1.4.3 动物实验

1.4.3.1 糖尿病小鼠模型的制备

参照Liu等人方法[9]，详见图1。六周龄的雄性昆明小鼠(20.0 g±2.0 g)，按体质量随机分为6组：空白对照组（CON组）、糖尿病组（DM组）、总膳食纤维组（TDF组）、可溶性膳食纤维组（SDF组）、不可溶性膳食纤维组（IDF组）、阿卡波糖阳性对照组（ACAR组），每组6只，并随机提供食物和水。对照组给予生理盐水腹腔注射，另外5组，禁食24 h，经腹腔注射四氧嘧啶(200 mg/kg体重)。36 h后禁食12 h，尾部取血测其空腹血糖值，当血糖小于15 mM并在注射后1周内保持血糖浓度为15 mmol/L～30 mmol/L时，建立糖尿病小鼠模型（DM组）。每天以0.2 mL/10 g体重的剂量分别将蒸馏水（CON组、DM组）、TDF、SDF、IDF、阿卡波糖（ACAR组：阳性对照组）给予小鼠进行灌胃，连续灌胃4周。

图1 动物模型建立过程图Fig.1 Animal model establishment process diagram

1.4.3.2 样品采集

实验结束，收集粪便样品，随后通过异氟烷处理处死小鼠，收集结肠内容物，所有结肠和粪便样品均保存在-20 ℃备用。

1.4.4 样品成分的测定方法

1.4.4.1 HE染色

将结肠置于中性福尔马林固定液中固定，经脱水、包埋、切片后，石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化，苏木精染色4 min，体积分数1%盐酸乙醇分化20 s，自来水和蒸馏水各洗2 min；稀氨水返蓝30 s，水洗2 min；伊红染色20 s，水洗2 min。脱水、透明、中性树胶封片，于显微镜下观察结肠组织[10,11]。

1.4.4.2 水分测定

每只小鼠称取50 mg结肠及粪便样品，然后保存在-20 ℃中。融化样品并立即放入120 ℃的干燥箱中，记录粪便样品的恒定重量。水分含量的计算参考Hu[12]等人的方法。

1.4.4.3 pH值测定

每只小鼠称取50 mg结肠及粪便样品，解冻后用五倍超纯水稀释，离心（3900×g，15 min）。收集上清液，用微量pH计测量pH值。

1.4.4.4 短链脂肪酸测定

用五倍超纯水稀释每只小鼠的10 mg粪便样品后离心（3900×g，15 min），收集上清液用于测定SCFAs。

分别稀释一定浓度梯度的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸标准品用于后期的气相色谱分析，根据绘制保留时间与有机酸浓度的标准曲线用于求解样品中6种有机酸的含量。有机酸标准品和所有样品使用Agilent 7890A GC和Agilent 5975C MS系统，气相色谱柱（HP-INNOWAX，190901N-213；J＆W Scientific，Santa Clara，CA, USA）,使用30 m×250 μm I.S，0.25 μm的色谱柱[9]。

1.4.5 DNA的提取和测序

使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组小鼠粪便样品中微生物总DNA，并以此为模板，使用引物515F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rDNA基因V4区域进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR条件：反应体系25 μL，DNA模板50 ng，上下引物各2.5 μL，PCR MIX 12.5 mL，用双蒸水定容至25 μL；反应条件：98 ℃预变性30 s，98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸42 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min。

PCR扩增产物利用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒回收DNA。利用Qubit dsDNA HS Assay Kit在Promega Quanti Fluor荧光定量系统上进行文库定量，梯度稀释浓度大于2 nM的上机序列文库，根据所需测序量按相应比例混合，经NaOH变性为单链，最后上机测序。

1.4.6 数据分析

利用Illumina MiSeq测序仪对样品进行2×250 bp的双端测序，overlap将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量cleandata.DADA2（Divisive Amplicon Denoising Algorithm），通过“去重复”（Dereplication，相当于以100%相似度聚类）等步骤获得单碱基精度的代表序列。DADA2的核心是去噪，使用ASVs（Amplicon Sequence Variants）的概念构建类OUT（Operational Taxonomic Units），获得最终的特征表以及特征序列，进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。

以上实验均设置3个平行，结果使用平均值±标准差（Mean±SD）的方式表示。采用美国IBM公司SPSS Statistics 25软件，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）中的邓肯法（Duncan）分析。

2 结果与讨论

2.1 膳食纤维对结肠组织形态结构的影响

肠道是机体最大的免疫器官，肠道黏膜担任着消化吸收和人体第一道防线的任务，维持黏膜的完整性至关重要[13]。本试验结果如图2所示，CON组和ACAR组的小鼠结肠黏膜上皮形态清晰，结构完整，未见溃疡及损伤情况；DM组肠黏膜的结构遭到破坏，坏死甚至脱落。摄入三种膳食纤维的高血糖小鼠在形态结构上有改善作用。在李耀东等人的研究中[14]，复方海藻膳食纤维可以降低经四氧嘧啶处理的糖尿病小鼠血糖，减轻高血糖对机体的毒害作用，本研究与其结果具有相似性。

图2 小鼠结肠组织学染色结果（200x）Fig.2 Results of histologically-stained islet in pancreas

2.2 膳食纤维对结肠及粪便水分的影响

由图3a可知，与DM组水分含量（72.87%）相比，其它组结肠中的水分含量均有显著差异（p＜0.5）；其中在TDF、ACAR组中结肠的水分含量高于CON组，且TDF组（78.73%）中结肠水分含量略高于ACAR组（78.43%），说明金柚幼果膳食纤维的干预可以使糖尿病小鼠在结肠中的水分含量有所改善，TDF的改善效果最为显著。各实验组小鼠粪便的水分含量相比于CON、DM组均有所升高，与DM组的差异极显著（p＜0.5），另外ACAR组在粪便中的水分含量为60.32%，高于各膳食纤维组。说明膳食纤维的摄入可以促进小鼠粪便的保湿能力。研究发现[15]，甘薯渣膳食纤维可改善大鼠便秘情况，提高肠道推进率，有效提高粪便内的含水量。在王娟[16]等人对香蕉膳食纤维的研究中，与模型组相比，中、高剂量组小鼠粪便含水量分别比模型组高了25.7%和36.7%，香蕉膳食纤维在体内显示出良好的吸水效果，能够增加小鼠粪便含水率。本研究结果与上述学者的研究结果相似，说明金柚幼果膳食纤维具有良好的吸水膨胀能力，促进排便，减少有毒有害物质对肠道的损伤。

2.3 膳食纤维对结肠及粪便pH值的影响

各组小鼠在结肠及粪便的pH值如图3b所示，从图中可以看出DM组之外各组小鼠pH值无统计学差异，且DM组显著高于正常组，说明小鼠患有糖尿病使肠道pH值升高，不利于双歧杆菌和乳酸杆菌等肠道有益菌的生存[17]；但是膳食纤维处理后各组小鼠肠道pH值显著下降，说明金柚幼果膳食纤维能降低糖尿病小鼠肠道pH值，更有利于有益菌的生长，改善肠道菌群。在杨光[7]等人的研究中，不同剂量的山楂膳食纤维，对小鼠粪便的pH值均有明显降低；同时，与对照组相比，低剂量组结肠内容物pH值降低了10.75%；在本研究中，TDF组小鼠结肠内容物pH值降低了19.14%，作用效果更显著。这证明金柚幼果膳食纤维可调节肠道内pH值，对维持肠道内环境的稳定性有一定的作用。

图3 膳食纤维对糖尿病小鼠结肠和粪便中水分含量(a)、pH值(b)的影响Fig.3 Effects of dietary fiber on water content (a) and pH (b) in colon and feces of diabetic mice

2.4 膳食纤维对结肠及粪便SCFAs的影响

由图4可知，除异戊酸外，各实验组结肠内酵解产物SCFAs均显著高于DM组，其中TDF组中的SCFAs含量最高。与DM组相比，TDF组结肠内酵解产物，6种短链脂肪酸含量分别提高111.46%、475.19%、121.79%、316.67%、410.97%、197.16%。说明添加膳食纤维能明显提升肠道内SCFAs含量。各实验组小鼠粪便中SCFAs含量相较于DM组均有显著性升高，IDF组乙酸提高量最显著，为196.36%，其余5种短链脂肪酸含量，以TDF组的变化最为显著，分别提高489.05%、702.56%、385.55%、162.00%、140.43%。说明金柚幼果膳食纤维具有提高结肠内容物质酵解反应发生速度的作用，产生大量短链脂肪酸。短链脂肪酸的增加可有效降低结肠内的pH值，从而促进有益菌增殖，抑制有害微生物繁殖[18]。研究发现[19]，山楂膳食纤维在肠道内被微生物利用后，发生酵解反应，能促使乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的产生。此外，苹果作为一种富含膳食纤维的水果，JIANG TT等人表明随着苹果摄入量的增加，粪便中乙酸的浓度也有增加的趋势[20]。这与本试验结果一致，且在本试验中TDF组效果最佳。

图4 膳食纤维对糖尿病小鼠结肠和粪便中乙酸(a)、丙酸(b)、正丁酸(c)、异丁酸(d)、正戊酸(e)、异戊酸(f)含量的影响Fig.4 Effect of dietary fiber on acetic acid (a), propanoic acid(b), butyric acid (c), isobutyric acid (d), n-valeric acid (e),isovaleric acid (f) content in colon and feces of diabetic mice

2.5 膳食纤维对高血糖小鼠肠道菌群的多样性分析

Venn图可以直观反映不同样本中共有和特有的OTU数，并且可以看出不同组别之间的关系及差异。同时Chao1指数、observed species指数和Shannon指数常用于表征菌群物种多样性[12]。从图5a可得出，SDF、TDF组的OTU数分别为789和597，明显高于空白对照组（73）和糖尿病组（425），其中SDF组的增加尤为显著，IDF组菌群含量处于空白对照组和糖尿病组之间。图5b～d显示对高血糖小鼠给予三种膳食纤维灌胃后，三种膳食纤维表现出不同的影响：TDF、SDF能在一定程度上改善糖尿病小鼠肠道菌群的丰富度，IDF未表现出对菌群丰富度和均匀度的上调作用。通过PCoA分析（图5e）可以看出，糖尿病组与其余组中细菌的组成差异性很大，其中SDF组相差最大，IDF组和TDF组中细菌组成相似度相对较高。可以看到SDF组与ACAR组是最接近的，这说明SDF组的效果相对明显。白冰瑶等研究发现[21]，红枣膳食纤维在0.60 g/(kg·d)条件下具有明显改善肠道菌群的生理功效。研究表明[13]，添加甘薯渣可溶性膳食纤维能够调节小鼠肠道菌群，且当添加0.5 g/L的可溶性膳食纤维能够最显著改变肠道菌群的数量及结构。本研究结果表明三种膳食纤维均能调节糖尿病小鼠的肠道菌群，并且膳食纤维的添加存在最适种类，当添加SDF能够显著改善小鼠肠道菌群的数量和结构，这与上述研究具有相似性。

图5 韦恩图及基于OTU总数的多样性指数图Fig.5 Venn diagram and diversity index graph based on the total number of OTUs

2.6 肠道菌群物种组成分析

在门（phylum）的分类水平上（图6a），可以得到在所有组别中，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria），这三种菌占肠道菌群总构成95%以上的含量。拟杆菌门在对照组和各实验组中均为优势菌群，第二优势菌群为厚壁菌门。由图可得厚壁菌门，在添加膳食纤维的组别中数量明显增多。厚壁菌门是肠道的有益菌，在肠道中能够帮助多糖发酵，维持肠道的健康。同时可以发现添加金柚幼果膳食纤维可以改变Firmicutes与Bacteroidetes的比率，并提高Firmicutes的数量，这与高美玲等人的研究结果一致[13]，其中本试验以TDF组的效果最为明显。

在属（genus）水平上（图6b），可以看出，拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）等在实验组和对照组中均有不同的含量。拟杆菌属（Bacteroides）在IDF组中含量最为丰富，在SDF组中含量最低。乳杆菌属（Lactobacillus）在ACAR组为优势菌种，而在其他实验组中的含量则低于空白组，SDF组与空白组的差异极小。乳杆菌是一种优质的益生菌，已有大量文献资料表明其具有促进肠上皮细胞增殖、参与调解结肠粘液层、重塑黏蛋白糖基化等功能[22,23]。

图6 小鼠肠道菌群在门与属水平上的物种组成分析柱状图Fig.6 Analysis of the composition of intestinal flora in mice at the level of phylum and genus

2.7 血糖相关指标与肠道菌群的相关性分析

基于前期研究结果[1]与本实验结果，通过相关性分析得到图7的相关性网络图，可以看出与血糖相关指标关联较大的主要是Mycoplasma（在Mollicytes纲中对照组占0%，SDF组占95%）、Paramuribaculum（在Muribaculaceae科中对照组占9%，SDF组占0%）、Odoribacter（在Muribaculaceae科中对照组占100%，SDF组占71%）和Lactobacillus这几种细菌。在杨慧等人的研究中[24]，具有促进肠道细胞生长特性的副干酪乳杆菌N115作为一种益生菌，有利于减缓糖尿病患者肠道微环境失衡问题，为更好地稳定血糖提供可能性。本研究使用Krona软件快速定位Lactobacillus在样品中的表达情况观察到，糖尿病小鼠的未分类副干酪乳杆菌（Lactobacillus_ unclassified）占比较小（16%），而正常小鼠占比89%，ACAR组达49%，SDF组则高达98%，可以得知在Lactobacillus中，未分类副干酪乳杆菌Lactobacillus_unclassified是众多调节血糖菌群中关键的一类。此与上述研究结果相似。研究发现[25]，糖尿病患者在血糖异常的同时常常存在肠道菌群失调，而菌群的紊乱又会加重糖尿病，造成恶性循环。高膳食纤维低血糖生成指数饮食可有效改善糖尿病患者的肠道菌群失调，从而改善高血糖引起的代谢紊乱[23]。还有研究发现，长链菊粉型果聚糖的摄入可使厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加，使抗糖尿病水平提高，进而抑制糖尿病的发病率[26]。结合上述研究，本试验发现金柚幼果膳食纤维对糖尿病小鼠血糖的影响可能与其进入肠道后被益生菌发酵，产生短链脂肪酸有关，从而改善肠道内环境，提高与降糖作用相关的肠道菌群的多样性和丰富度。

图7 相关性网络图Fig.7 Correlation network diagram

3 结论

HE染色实验表明金柚幼果膳食纤维在一定程度上可以减缓因糖尿病导致的肠道黏膜损伤，从而维持肠粘膜的完整性。同时，金柚幼果膳食纤维课提高糖尿病小鼠在结肠及粪便中的水分含量、SCAFs含量，降低pH值水平，表明金柚幼果膳食纤维对糖尿病小鼠肠道内环境具有调节作用。在肠道菌群的影响方面，金柚幼果膳食纤维可以调节肠道菌群的结构，促进厚壁菌门、副干酪乳杆菌等有益菌群繁殖，同时抑制厚壁菌门、变形菌门等微生物的增值，调节拟杆菌门与厚壁菌门菌群的比例，可以为有益微生物提供有利生长条件，有效预防因肠道有害微生物繁殖引起相关肠道疾病，从而保障肠道健康。本实验提供金柚幼果膳食纤维改善糖尿病小鼠肠道健康的可能机制是其进入肠道后，通过提高有益菌的比例，促进短链脂肪酸的生成。本实验也为金柚幼果膳食纤维进一步的开发与应用提供了一定的理论依据。