艾地苯醌对血管性痴呆大鼠海马突触再生和可塑性的影响

钱旭东 王东 徐倩倩 李国芸 王红梅 张晓璇 马征

(承德医学院附属医院 1神经内科，河北 承德 067000；2呼吸内科)

我国血管性痴呆(VD)的发病率不断上升，目前仅次于阿尔茨海默病(AD)，痴呆患者中大约有1/5是VD患者〔1〕。突触是神经信息传递与处理过程的中心环节，研究报道称神经突触的超微结构与认知功能密切相关，表明突触的数量及功能状态对认知功能有决定性作用〔2，3〕。对艾地苯醌在VD方面的研究发现，其能促进 VD 大鼠海马组织脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，而 BDNF 与其受体共同作用可促进突触再生，提高突触可塑性，从而改善 VD 大鼠痴呆状况〔4〕。为进一步明确艾地苯醌对 VD 大鼠海马区突触的影响，本研究从突触相关蛋白的表达和突触超微结构的角度进行研究。

1 资料与方法

1.1实验动物 实验动物 SPF级，体重250～300 g，7周龄，健康SD清洁级雄性大鼠40只，动物使用许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，动物合格证编号：1404010，来源河北医科大学实验动物中心。在湿度50%～70%、室温20℃～25℃中饲养，每笼5 只，喂养普通颗粒型大鼠饲料，正式实验之前，适应性饲养1 w。

1.2试剂与仪器 小鼠抗大鼠微管相关蛋白(MAP)-2抗体、小鼠抗大鼠突触素(SYP)抗体及小鼠抗大鼠突触后密度蛋白(PSD)-95抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，山羊抗小鼠〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗〕购自上海Abcam公司，Western印迹ECL化学发光检测试剂盒购自美国Bio-Rad公司，ZS-001 Morris水迷宫购自北京众实迪创科技发展有限公司，TH4-200倒置显微系统购自日本OLYMPUS。

1.3动物建模与分组 适应性喂养1 w后，按照随机数字表将大鼠分为手术组(n=28)及假手术组(n=12)。手术组采用改良双血管阻断(2-VO)法建立大鼠 VD 模型，具体方法为：大鼠采用异氟烷吸入麻醉后先分离右侧颈总动脉并两端结扎，从结扎中心剪断颈总动脉，分层缝合并以青霉素 40万U/只局部注射预防感染，1 w后以同样方法处理左侧颈总动脉。假手术组不结扎及剪断颈总动脉，其余操作步骤同手术组。模型建立6 w后，运用Morris 水迷宫方法挑选28只成功建模的大鼠。(逃避潜伏期各时段成绩均值-平均对照组逃避时间)/逃避潜伏期该组大鼠均值≥0.2作为模型成功的辨别条件。将28只成模大鼠平均分为两组，分别是艾地苯醌组、模型组，两组给药采取腹腔注射，10 mg/kg，持续给药4 w，模型组及假手术组注入等量的生理盐水。

1.4大鼠学习记忆能力检测 给药30 d后，对每组大鼠进行Morris 水迷宫实验，持续6 d，前5 d用于定位航行，空间探索实验利用最后1 d。水温稳定在22℃左右，水深约0.35 m，用摄像头跟踪老鼠的位置。通过水迷宫分析系统对采集的图像及视频进行数据分析。定位航行测试：进水点是以每个象限的中点为标记，统计2 min内大鼠发现平台的位置，停留在平台上时间超过2 s是避开潜伏期。1天4次，算出平均值。空间探索测试：撤除原平台，将大鼠随机选一进水点放入水中，统计2 min内大鼠穿越原平台的次数和停留时间。

1.5免疫组织化学检测 取各组大鼠脑组织切片通过二甲苯对石蜡切片进行两次脱蜡过程，使用酒精梯度清洗脱蜡后的组织：二甲苯孵化5 min，弃二甲苯，重新添加二甲苯再次孵化5 min，无水乙醇、无水乙醇Ⅱ洗涤、95%乙醇依次洗涤3 min，80%乙醇 洗涤3 min，而后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min；将切片放至含有0.01 mmol/L柠檬酸缓冲液中，对切片进行恢复，并放入微波炉，加热15 min，冷却至室温；将石蜡切片取出，放置在3% H2O2中(13±2)min，然后使用PBS洗涤3次；按照1∶500的比例加入NMDAR抗体，对石蜡组织切片进行室温孵育1 h或者4℃孵育过夜，之后用PBS冲洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入HRP二抗，对石蜡组织切片进行室温孵育40 min，之后用PBS冲洗3次，每次3 min；加入DAB试剂盒中的显色剂，室温孵育5～10 min，然后清水冲洗；再进行苏木素复染室温孵育3～5 min，清水冲洗；对染色后的切片进行梯度酒精水化处理，采用树脂进行封胶固定后观察。对组织切片中的NMDAR采取上述相同的操作方法进行免疫组织化学染色观察。

1.6突触显微结构观察 每组选择 3 只大鼠，使用10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后进行断头处死，此时对脑组织进行快速剥离，顺着视交叉前端切一个冠状面，选取3 块、大小约为1 mm3的大鼠左边脑部CA1 区海马组织，按照固定-漂洗-脱水-渗透-包埋顺序操作后，制作60～80 nm超薄切片。采用铀铅进行双染色，并经充分沥水过夜后，利用透射电镜研究突触情况。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验及方差分析。

2 结 果

2.13组学习记忆能力比较 连续给药1 w后，与假手术组比较，模型组逃避潜伏时间明显增高，而穿越平台次数明显减少(均P<0.05)；与模型组比较，艾地苯醌组逃避潜伏时间明显减少，而穿越平台次数明显增高(均P<0.05)。见表1。

表1 3组学习记忆能力比较

2.23组海马相关突触蛋白的表达 3组MAP-2、SYP、PSD-95表达水平比较：艾地苯醌组>假手术组>模型组(均P<0.05)。见表2，图1、图2。

表2 3组海马突触蛋白表达比较

图1 各组海马MAP-2表达(DAB，×400)

图2 各组海马突触相关蛋白表达(DAB，×400)

2.33组突触超微结构的变化 假手术组突触结构完整，突触间隙清晰可见，突触前后膜间吻合良好，突触后膜可见均匀增厚，突触曲面弧度规整，突触小泡丰富，有结构完整的线粒体；模型组无突触间隙，前后突触膜界限难以区分，弧度不整齐，具有较少的突触小泡，线粒体出现肿大或消失；艾地苯醌可见清晰突触间隙、均匀增厚的突触后膜，突触结构大体完整，有较多的突触小泡和完整、丰富的线粒体结构。见图3。

图3 各组突触超微结构(×3 000)

3 讨 论

VD是最常见的认知功能障碍病因之一，病变的脑血管引起全脑或局部供血、供氧不足，从而导致参与认知记忆等脑部特定神经组织受损可能与其发病的机制相关〔5〕。中枢神经系统对缺血缺氧有高度的敏感性，特别是小脑、海马、大脑皮质(第三层)等部位〔6〕。脑缺血受损会引发级联反应，比如氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、脑梗死周围去极化、兴奋性氨基酸毒性及能量衰竭等环节会使突触传递和神经递质调控受到影响，促使神经元突变受损，进而使学习记忆功能出现障碍〔7〕。大鼠和人类一样，具有完整的Willis环，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型，而双侧颈总动脉阻断后可导致大鼠海马慢性供血不足。海马CA1区神经元对缺血、缺氧损害极其敏感，颈总动脉阻断导致的缺血缺氧性病变势必导致神经元凋亡及突触的变性和丢失，使突触数量下降，可塑性降低，突触相关蛋白表达发生改变，并进一步影响突触的结构与功能〔8，9〕。研究表明，突触相关蛋白可调控突触的生长、发育、成熟，并与突触可塑性密切相关，当其表达发生变化后会导致个体产生交流缺陷、认知功能受损与感觉、焦虑等神经精神症状及社会活动缺陷等，因此突触相关蛋白的表达是突触数量及功能状态的标志，能够从微观层面反映突触的病理生理变化〔10〕。

本研究发现，艾地苯醌能明显改善VD大鼠的学习记忆能力。免疫组化检测则进一步证实艾地苯醌能明显促进突触相关蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表达。SYP是一种突触前囊泡特定蛋白，由313个氨基酸组成，分子量38 kD，对突触形成和突触功能的维持意义重大，是突触重建的重要标志〔10〕。SYP可作为突触结构的标志物，在神经外科手术中常用来标记突触终末，避免神经损伤。作为树突生长神经元标志蛋白的MAP-2主要在突触后致密区、树突棘、树突、神经元胞体中表达，与树突棘的功能及形态和突触可塑性紧密关联，有调控突触可塑性，促进神经元突起成形等作用，与癫痫等疾病密切相关〔11〕。PSD-95是一种由724个氨基酸构成的突触后蛋白，与突触的可塑性、学习记忆等相关，其变异可导致个体智能障碍〔12〕。PSD-95不仅参与突触信号的修饰，而且对树突棘从生长-发育-分支-成熟的过程中都扮演着主要的作用。神经元PSD-95的表达增多和突触兴奋性增强相关，而AD及轻度认知障碍(MCI)患者的神经元PSD-95表达则明显下降〔13～16〕。艾地苯醌MAP-2表达水平上升提示艾地苯醌对树突成形和新突触形成有促进作用，改善突触可塑性，增强大鼠的学习和记忆能力；另一方面，艾地苯醌大鼠SYP与PSD-95也明显升高，说明艾地苯醌能够保存现有突触，并促进了突触重建与再生，从而保护了缺血缺氧损伤的神经组织。PSD-95与MAP-2表达水平提升说明生成的神经元树突及增多和成熟的树突棘创造了突触重建的条件。电镜观察也进一步表明大鼠经艾地苯醌治疗后有正常突触结构，丰富的突触囊泡，突触的尺寸变大，这些变化为神经信息的有效传递和治疗提供了物质基础。模型组无突触间隙，前后突触膜界限难以区分，无正常曲面，弧度不整齐，有较少的突触小泡，线粒体出现肿大或消失；PSD-95、MAP-2、SYP比假手术组和艾地苯醌明显降低，提示学习记忆能力下降与突触损害、萎缩或凋亡紧密相关。

综上，艾地苯醌可能对强突触相关蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表达以上调的方式，改善学习记忆功能。动物实验表明艾地苯醌还能促使突触再生，确保了突触的生理结构及功能正常，为神经信息有序高效的处理创造了物质前提。