三阴性乳腺癌患者新辅助化疗后血清miR-335、miR-146a的表达及临床意义

王冰，王月鹏，陈北平

(盘锦市中心医院肿瘤内科，辽宁盘锦124000)

三阴性乳腺癌(triple-negative breast carcinoma，TNBC)患者乳腺癌组织免疫染色检测雌、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达均为阴性，约占乳腺癌的15%～20%。新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NAC)已广泛用于治疗TNBC，但肿瘤对化疗药物具有耐受性[1]，因此，TNBC生物学标志物用于NAC疗效预测成为目前研究热点。微小RNA(microRNA，miRNA)作为内源性非编码单链RNA，调控大部分基因的表达，在应激反应、细胞增殖等进程中发挥重要作用[2]。研究发现，miR-335和miR-146a异常表达与乳腺癌细胞的增殖、侵袭有关[3-4]。有学者发现，血清miR-335表达降低参与了乳腺癌发生，可作为早期诊断乳腺癌的指标[5]；miR-146a过表达可增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性[6]。但二者与NAC治疗后TNBC发生、发展的关系尚不十分明确。本研究旨在测定TNBC患者血清miR-335和miR-146a的表达水平，并分析其与NAC疗效、患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2016年6月至2018年6月盘锦市中心医院肿瘤内科就诊且经NAC治疗并行改良根治性手术、乳腺癌保乳手术、乳腺单切除的TNBC患者84例作为TNBC组，年龄(45.06±4.07)岁，均为女性。纳入标准：(1)经病理组织学确诊为TNBC[7]；(2)非哺乳期或妊娠期患者；(3)临床病理资料完整。排除标准：(1)除三阴性乳腺癌外还患有其他肿瘤；(2)肝肾功能不全者。其中浸润性导管癌71例，浸润性小叶癌13例。未绝经患者49例，绝经患者35例。美国癌症联合委员会(american joint committeeon cancer，AJCC)临床分期：Ⅱ期54例，Ⅲ期30例。另选取行手术治疗的非三阴性乳腺癌患者84例(乳腺纤维腺瘤37例，乳腺导管扩张症25例，乳腺囊性增生22例)作为非TNBC组，年龄(44.93±5.08)岁，均为女性；收集同期于体检中心体检健康者84例作为健康人对照组。年龄(44.27±5.19)岁，均为女性。3组受试者年龄间差异无统计学意义(F=0.652，P=0.522)。本研究经盘锦市中心医院医学伦理委员会批准(批准文号：2015117)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2TNBC患者NAC方案及随访 所有TNBC患者手术前均接受NAC方案：阿霉素联合环磷酰胺、表阿霉素联合环磷酰胺或紫杉类药联合以上方案。4个疗程后行手术治疗，手术后继续化疗2个疗程，化疗过程中根据病情需要可提前进行手术治疗。NAC治疗后64例患者行改良根治性手术，12例患者行保乳手术，8例患者行乳腺单切除手术。根据NAC治疗后是否病理完全缓解(pathologic complete response，pCR)，分为pCR组32例和非pCR组52例。TNBC患者出院后，采取电话随访、门诊复查、住院检查的方式进行随访，随访时间为6～36个月，以患者死亡、失访或最后1次随访时间为终点。记录随访期间患者的生存状况。

1.3样本采集 健康人对照组于体检当日，非TNBC组患者于入院第2日清晨，TNBC组患者于NAC治疗前及治疗4、6个疗程后，采集清晨空腹静脉血6 mL，室温下静置20 min，4 ℃、5 000 r/min离心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃保存。

1.4试剂和仪器 RNA提取试剂盒(北京索莱宝公司),逆转录试剂盒及实时荧光定量(quantitative real-time，RT-qPCR)试剂盒(美国Bioworld公司)。UV-3200紫外分光光度计(上海美谱达仪器公司),CFX96型RT-qPCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.5RT-qPCR检测血清中miR-335、miR-146a的表达水平 取各组血清样本100 μL，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，取UV-3200紫外分光光度计检测吸光度(A260/280 nm)值为1.8～2.0之间的样本，置于-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。根据GenBank中提供的miR-335(序列号：NC_000072.7)、miR-146a(序列号：NC_000005.10)及U6(序列号：NC_015438.3)的基因序列，由上海吉玛生物公司设计并合成。miR-335上游引物序列：5′-TAGCTTATCAGACTG-A-3′，下游引物序列：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，退火温度60 ℃，产物片段大小217 bp。miR-146a上游引物序列：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物序列：5′-CCCATGGAATTCAGTTCTCATT3′，退火温度63 ℃，产物片段大小269 bp。U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，退火温度60 ℃，产物片段大小253 bp。按照RT-qPCR试剂盒说明书进行扩增，PCR总反应体系为20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 4 μL。循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 s，共45个循环。以U6为内参照，采用2-△Ct法对miR-335、miR-146a的表达水平进行定量分析。

1.6统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行数据的处理和分析，计量资料采用两独立样本t检验，率的比较采用χ2检验，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析，存在差异时以LSD-t检验进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。采用Pearson检验分析NAC治疗前后TNBC患者血清miR-335与miR-146a表达水平的相关性；采用Kaplan-Meier法分析NAC治疗后miR-335、miR-146a表达水平与TNBC患者3年生存率的关系；采用Cox回归分析影响TNBC患者NAC治疗后预后的危险因素。

2 结果

2.1各组血清miR-335、miR-146a表达水平的比较 健康人对照组miR-335、miR-146a的表达水平分别为1.02±0.12、1.01±0.12，非TNBC组miR-335、miR-146a的表达水平分别为0.81±0.20、0.87±0.22，TNBC组miR-335、miR-146a的表达水平分别为0.43±0.08、0.56±0.11，3组间比较差异均有统计学意义(F值分别为370.678、178.430，P均<0.01)。此外，与健康人对照组相比，非TNBC组、TNBC组血清miR-335、miR-146a的表达水平均降低(miR-335的t值分别为13.520、37.984，miR-146a的t值分别8.121、26.102，P均<0.05)；与非TNBC组相比，TNBC组血清miR-335、miR-146a的表达水平均降低(t值分别为24.464、17.981，P均<0.05)。

2.2TNBC患者NAC治疗前后血清miR-335、miR-146a表达水平的比较 NAC治疗前miR-335、miR-146a的表达水平分别为0.43±0.08、0.56±0.11，NAC治疗4个疗程后miR-335、miR-146a的表达水平分别为0.51±0.10、0.70±0.18，NAC治疗6个疗程后miR-335、miR-146a的表达水平分别为0.75±0.17、0.83±0.21，3组间比较差异均有统计学意义(F值分别为154.278、51.860，P均<0.01)。与NAC治疗前相比，NAC治疗4、6个疗程后血清miR-335、miR-146a的表达水平均升高(miR-335的t值分别为5.967、23.867，miR-146a的t值分别7.466、14.399，P均<0.05)；与NAC治疗4个疗程后相比，NAC治疗6个疗程后血清miR-335、miR-146a的表达水平均升高(t值分别为17.900、6.933，P均<0.05)。

2.3NAC治疗前miR-335和miR-146a的表达与TNBC患者临床病理参数关系 血清miR-335、miR-146a表达水平与TNBC患者年龄、临床分期、肿瘤大小无关(P>0.05)，而与有无淋巴转移、有无脉管瘤栓相关(P<0.05)。结果见表1。

表1 NAC治疗前miR-335和miR-146a的表达与TNBC患者临床病理参数的关系

2.4NAC治疗前TNBC患者血清miR-335与miR-146a表达水平的相关性 Pearson检验分析发现，NAC治疗前TNBC患者血清miR-335与miR-146a的表达水平呈正相关(r=0.493，P=0.000)，NAC治疗4、6个疗程后TNBC患者血清miR-335与miR-146a的表达水平呈正相关(r分别为0.385和0.402，P均=0.000)。

2.5NAC治疗前miR-335、miR-146a表达水平与化疗疗效的关系 非pCR组miR-335的表达水平为0.38±0.06，显著低于pCR组的(0.51±0.09)，差异有统计学意义(t=7.947，P=0.000)；而非pCR组miR-146a的表达水平为0.50±0.09，显著低于pCR组的(0.66±0.12)，差异亦有统计学意义(t=6.956，P=0.000)。

2.6NAC治疗后miR-335、miR-146a表达水平与TNBC患者3年生存率的关系 根据NAC治疗后miR-335均值(0.75)，将其分为低表达组(44例)和高表达组(40例)，根据NAC治疗后miR-146a均值(0.83)，将其分为低表达组(42例)和高表达组(42例)。分析结果表明，经NAC治疗后miR-335低表达、miR-146a低表达组TNBC患者的3年生存率(13.64%和11.90%)均显著低于miR-335高表达和miR-146a高表达(32.50%、33.33%)组患者(χ2值分别为4.260、5.509，P分别为0.039、0.019)。NAC治疗后miR-335低表达组TNBC患者的中位生存时间(25.60个月)和miR-146a低表达组患者的中位生存时间(23.80个月)均显著少于miR-335高表达组患者(33.20个月)和miR-146a高表达组患者(33.02个月)，差异有统计学意义(t值分别为4.524、5.009，P均=0.000)，结果见图1、2。

图1 NAC治疗后miR-335表达与TNBC患者生存率关系

图2 NAC治疗后miR-146a表达与TNBC患者生存率的关系

2.7影响TNBC患者预后的危险因素 Cox回归分析结果表明，有脉管瘤栓、NAC治疗后miR-335和miR-146a低表达是影响TNBC患者不良预后的独立危险因素(P均<0.05)。见表2。

表2 影响TNBC患者NAC治疗后预后的危险因素分析

3 讨论

miR-335在多种肿瘤中呈异常表达，可能参与了肿瘤的发生、发展进程。研究表明，miR-335低表达与子宫内膜癌发生有关，可作为潜在的诊断标志物[8]。本研究结果发现，血清miR-335表达水平由高至低依次为健康人对照组、非TNBC组、TNBC组，NAC治疗6个疗程后、NAC治疗4个疗程后、NAC治疗前。这与Hao等[9]研究结果相似，其证实TNBC组织中miR-335呈低表达，且miR-335过表达可增加癌细胞对紫杉醇、顺铂和阿霉素的敏感性，提高化疗效果[9]。故而笔者推测血清miR-335表达水平升高可能与TNBC发生有一定关联，而NAC治疗能上调TNBC患者血清中miR-335的表达水平，表明NAC治疗可能通过调控miR-335表达改善TNBC疾病状态。本研究进一步分析发现，血清miR-335水平与TNBC患者有无淋巴转移、有无脉管瘤栓有关，提示miR-335可能参与TNBC发展进程。此外，与pCR组相比，非pCR组miR-335的表达水平较低，miR-335低表达组TNBC患者3年生存率显著低于miR-335高表达组患者，且患者中位生存时间也较短，与余进松等[10]的研究结果相似，提示miR-335可能与NAC疗效、患者预后有关。

miR-146a作为免疫反应调控因子，在乳腺癌等多种恶性肿瘤中发挥重要的作用[11]。本研究发现，血清miR-146a表达水平由高至低依次为健康人对照组、非TNBC组、TNBC组，NAC治疗6个疗程后、NAC治疗4个疗程后、NAC治疗前，且组间两两比较差异均有统计学意义。提示miR-146a可能参与了TNBC发病过程，而NAC治疗能上调TNBC患者血清中miR-146a的表达水平，提示miR-146a高表达可能有助于TNBC治疗，其作用机制可能是miR-146a可通过阻滞乳腺癌细胞周期进程，进而发挥抑制乳腺癌细胞增殖的作用[12-13]。miR-146a与TNBC患者有无淋巴转移、有无脉管瘤栓相关，与付明刚等[13]研究结果类似，提示miR-146a可能通过某种机制在TNBC发生、发展中发挥作用。笔者通过预后随访发现，与pCR组相比，非pCR组miR-146a的表达水平较低，miR-146a低表达TNBC患者的生存率亦低于miR-146a高表达患者，且低表达患者的中位生存时间更短，提示miR-146a高表达可能有助于提高NAC疗效，延长患者生存时间。但本研究随访时间相对较短，今后需延长随访年限，继续探讨miR-146a与TNBC患者远期生存的关系。本研究进一步行Pearson检验分析发现，NAC治疗前TNBC患者血清miR-335与miR-146a的表达水平呈正相关，且二者低表达是影响NAC治疗后TNBC患者不良预后的独立危险因素，提示miR-335、miR-146a有望成为评价NAC治疗后TNBC患者预后的血清学指标。

综上所述，NAC治疗可上调TNBC患者血清miR-335、miR-146a的表达水平，且与有无淋巴转移、有无脉管瘤栓、NAC疗效、患者生存率有关，有望成为评价NAC疗效和预后的生物学指标，但二者参与调控TNBC机制有待于进一步研究。