柱前衍生-气相色谱-串联质谱法检测鹅肉中青霉素G残留量

谢星 刘楚君 陈晋元 贺兆源 卢阳 王冉 谢恺舟

摘要：建立了鹅肉中青霉素G残留的柱前衍生-气相色谱-串联质谱检测方法。鹅肉通过加速溶剂萃取（ASE 350），0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH值8.0）提取，所得提取液过HLB（60 mg/3 mL）固相萃取柱净化，净化液经N2吹干后，乙醇复溶，三甲基硅烷基重氮甲烷（TMSD）衍生，所得衍生产物供气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测分析，色谱柱为TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），采用EI模式，全扫描（SCAN）和选择离子监测（SIM）方式定性，选择反应监测（Auto SRM）方式结合外标法定量。结果表明，鹅肉中青霉素G在4.50～100.00 μg/kg添加范围时，回收率为80.67%～91.02%，相对标准偏差（RSD）为1.57%～2.58%，日内RSD为2.72%～4.47%，日间RSD为3.51%～5.14%。鹅肉中青霉素G检测限为1.50 μg/kg，定量限为4.50 μg/kg，该方法灵敏度高，定性、定量准确，适用于鹅肉中青霉素G残留的确证检测。

关键词：鹅肉;青霉素G;残留;柱前衍生;气相色谱-串联质谱法

中图分类号：TS251.7   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）11-0132-06

收稿日期：2020-09-06

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-41-G23）;江苏高校优势学科建设工程资助项目（编号：PAPD）。

作者简介：谢 星（1989—），女，江苏扬州人，博士，助理研究员，主要从事动物产品安全研究。Email：yzxx1989@163.com。

通信作者：谢恺舟，博士，教授，主要从事动物产品品质、安全与兽药残留检测方法研究。E-mail：yzxkz168@163.com。

青霉素G主要作用于革兰氏阳性菌，是临床上常用的一类抗生素。对家禽而言，青霉素G可以预防敏感菌所致的全身（局部）感染 [1]，应用过程中常存在使用不合理和不规范现象，导致禽肉中青霉素G残留量超标，最终危害人体健康。因此，各国对动物性组织中青霉素G残留限量制定了严格标准，其中，欧盟、日本、加拿大和中国农业农村部规定鸡组织中青霉素G的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）均为50 μg/kg [2-5]。本研究参考上述MRL标准建立鹅肉中青霉素G残留的确证检测方法。

目前，国内外关于检测动物性食品中青霉素G的方法虽然已有微生物法 [6]、免疫分析法 [7]、薄层色谱法 [8]、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV） [9]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS） [10]等，但使用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）检测动物性组织中青霉素G残留的方法还未有报道。与其他方法相比，柱前衍生-气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）灵敏度高、抗干扰能力强、前处理简单和快速。因此，本研究旨在建立GC-MS/MS检测鹅肉中青霉素G残留的确证分析方法，为动物源性食品中青霉素G残留检测标准的制定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱-串联质谱仪（配有Trace 1300型气相色谱仪、TSQ 8000型三重四级杆串联质谱仪、Triplus RSH自动进样器）（美国Thermo Fisher公司）、加速溶剂萃取仪（ASE 350型，美国Thermo Fisher公司）;电子分析天平（AE260S型，瑞士Mettler Toledo公司）;漩涡混合器（G560E型，美国Scientific Industries有限公司）;全自动多管涡旋振荡器（TBOYS型，美国Troemner有限责任公司）;烘箱（FD115型，德国Binder公司）;氮吹仪（N-EVAP-112型，美国Organomation公司）;超纯水制备仪[Smart2-Pure型，賽默飞世尔科技（中国）有限公司];实验室pH计[FE20型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]等。

青霉素G钾标准品（纯度≥98%，CAS号为113-98-4，美国SIGMA-ALDRICH有限公司）;三甲基硅烷基重氮甲烷[TMSD，CAS号为18107-18-1，阿拉丁试剂（上海）有限公司];乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck有限公司）;乙醇（色谱纯，美国Fisher公司）;十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、正己烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;超纯水 [电阻率为18.2 MΩ·cm（25 ℃），符合国家实验室用水标准（GB 6682—1992）]。

1.2 主要溶液的配制

准确称取青霉素G标准品10.20 mg（纯度为98%）置于10 mL的棕色容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为1.00 mg/mL的标准品储备液，并将标准品储备液用乙醇分别准确逐级稀释成100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL标准工作液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液：准确称取67.7 g十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和1.5 g磷酸二氢钾（KH2PO4），采用超纯水溶解并定容至1 000 mL，配成0.2 mol/L pH值8.0的磷酸盐缓冲溶液。

10%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠固体1.0 g，用超纯水溶解并定容至10 mL，配成10 mg/g氢氧化钠溶液。

1%甲醇乙腈溶液：量取5 mL甲醇于500 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，配成1%甲醇乙腈溶液。

80%乙腈：量取20 mL水于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，配成80%乙腈溶液。

1.3 试验方法

1.3.1 试验鹅饲养与样品采集

随机选取70日龄扬州鹅（扬州天歌鹅业发展有限公司）公鹅10羽、母鹅10羽，单笼饲养，试验期间均饲喂不添加任何药物的全价饲料（扬州市扬大饲料厂提供），自由饮水。饲养14日后屠宰，采集试验鹅胸大肌肌肉作为空白样品，分装并密封，置于-34 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 样品提取

准确称取（2.0±0.02） g均质好的空白样品和4.0 g硅藻土置于研钵中，将其研磨成小颗粒，填入22 mL萃取池，萃取池置于ASE 350进行提取，设置参数，压力：10.34 MPa;加热温度：30 ℃;静态提取时间：5 min;冲洗溶剂总量：40%;每个样品之间自动冲洗1次;氮气吹扫时间：60 s;首先用正己烷去除样品中的脂肪，提取1次，弃掉提取液;其次用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH值8.0）提取样品中的目标物，提取2次，收集提取液，待用。

1.3.3 样品净化与浓缩

将“1.3.2”节中收集的提取液经过HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）净化，自动固相萃取步骤见表1。收集的洗脱液置于氮吹仪中35 ℃吹干，待用。

1.3.4 样品复溶与衍生化

将“1.3.3”节中氮吹至干的净化收集液加入100 μL乙醇溶解，涡旋混匀1 min，然后加入400 μL TMSD，密封，于30 ℃烘箱中避光反应30 min后取出，乙醇定容至1.0 mL，然后转移至2.0 mL具塞离心管中，涡旋混匀1 min，常温下12 000 r/min离心10 min，经过0.22 μm有机相针头式滤器过滤，滤液供GC-MS/MS检测。

1.3.5 气相色谱与质谱条件

毛细管色谱柱：TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm，美国Thermo Fisher公司）;载气：高纯氦气（>99.999%，413.7 kPa），流速：1.0 mL/min。進样口温度：280 ℃;分流模式：不分流进样;分流流量：50.0 mL/min;不分流时间：1.0 min;载气模式：恒流模式;载气流速：1.0 mL/min;2 min后开阀，载气节省时间2 min，载气节省流量20.0 mL/min;进样体积：1.0 μL。程序升温步骤见表2。

电离模式：电子轰击离子源（EI）;电子束能量（电离能）：70 eV;碰撞气：高纯氩气（>99.999%，275.8 KPa）;离子源温度：280 ℃;传输线温度：280 ℃;溶剂延迟：5.0 min;采集数据模式：全扫描（SCAN）和选择离子监测（SIM）方式定性，选择反应监测（Auto SRM）方式定量。

1.3.6 标准曲线绘制

按“1.3.2”节处理方法制备空白鹅肉基质提取液，分别移取适量的空白基质提取逐级稀释青霉素G的标准工作液，使青霉素G的添加浓度为定量限（LOQ）、15.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg/kg。将各浓度样品按“1.3.3”节、“1.3.4”节样品前处理方式进行GC-MS/MS检测分析，每个浓度重复测定6次，取平均值。以青霉素G标准工作液在空白基质中添加浓度为横坐标（x），以青霉素G衍生产物的定量离子对m/z 174.1>114.1*的峰面积为纵坐标（y），绘制基质标准曲线并作为待测样品的定量曲线。

1.3.7 样品加标回收率和精密度测定

准确称取2.0 g均质好的空白鹅肌肉样品，按“1.3.2”节的方法将空白样品与硅藻土充分研磨均匀，加入青霉素G标准工作液适量，使其最终在每个空白样品中的添加浓度为LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL，每个添加浓度设6个平行，按“1.3.3”节、“1.3.4”节的方法处理进行GC-MS/MS检测，最终将检测结果带入空白基质标准曲线中求得浓度，计算样品加标回收率。将LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL浓度样品在1 d内不同时间用同一标准曲线和1周内不同天和不同标准曲线用均用同一台GC-MS/MS重复测定6次，分别计算日内和日间精密度。

1.3.8 灵敏度测定

采用空白基质提取液逐级稀释低浓度的青霉素G标准工作液，用已建立的GC-MS/MS 方法进行检测。每个浓度进行6次重复测定，计算平均信噪比（S/N）。当S/N≥3时，所对应的青霉素G浓度作为该方法的检测限（LOD）;当S/N≥10时，所对应的青霉素G浓度作为该方法的定量限（LOQ）。

2 结果与分析

2.1 母离子和子离子的确定

准确吸取青霉素G与TMSD衍生后的标准溶液（100.0 μg/mL）用电子轰击离子源（EI）进行全扫描（Full SCAN）和选择离子扫描（SIM），获得衍生产物的全扫描色谱图和质谱图，根据质谱图分析特征离子结构，同时，参照Preu等提出的青霉素G与重氮甲烷反应的质谱图结构和梯度试验 [11]，挑选质荷比（m/z）比较大且丰度比较高的母离子，最终得到衍生产物的质谱图。由图1可知，青霉素G衍生产物的母离子是m/z 174.1。

确定好母离子（即定量离子）后，就需考虑子离子（即定性离子）的选择。采用Auto SRM优化仪器方法，查看母离子在不同碰撞能下产生的子离子碎片强度信息，选择合适的碰撞能和较大强度的碎片离子作为子离子。由母离子与子离子组合为监测离子对。为对青霉素G衍生产物进行准确的定性、定量，本研究选择3个响应强度较高且稳定存在的监测离子对。青霉素G三甲基硅甲酯的保留时间和相关质谱参数见表3。

2.2 色谱图

空白鹅肉样品总离子流色谱图（TIC）和定量、定性离子的质量色谱图（MC）及空白鹅肉添加50.0 μg/kg 青霉素G标准品的总离子流色谱图（TIC）和定量、定性离子的质谱图（MC）。由图2、图3可知，在优化的样品前处理和GC-MS/MS条件下，青霉素G与TMSD反应的衍生产物与杂质良好地分离，峰形正常良好，保留时间在10.85 min。

2.3 基质标准曲线的绘制

以青霉素G标准工作液在不同空白基质中添加浓度为横坐标（x），青霉素G衍生产物的定量离子对m/z 174.1 > 114.1*的峰面积为纵坐标（y），绘制基质标准曲线（图4）。由图4可知，青霉素G线性范围为4.50～200.0 μg/kg时，回归方程为y=27 567x-38 053，决定系数r2为0.999 6。

2.4 添加回收率和精密度

青霉素G在空白鹅肌肉的添加浓度为LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL时，青霉素G的添加回收率及精密度见表4。由表4可知，青霉素G在鹅肌肉中的添加浓度范围在LOQ～2.0 MRL之间时，青霉素G在鹅肌肉中的添加回收率为80.67%～91.02%，相对标准偏差（RSD）为1.57%～2.58%，日内RSD为2.72%～4.47%，日间RSD为3.51%～5.14%。

2.5 检测限与定量限

经灵敏度测定，鹅肌肉中青霉素G的检测限（LOD）为1.50 μg/kg、定量限（LOQ）为4.50 μg/kg。

3 讨论

3.1 毛细管色谱柱的选择

由于青霉素G属于β-内酰胺类抗生素，其β-内酰胺环的羰基α-碳上有一个酰胺基侧链，而在它稠和的环上有1个2位-羧基 [12]，故青霉素G属于强极性化合物。因为GC-MS/MS只能检测极性低、沸点低的化合物，所以不能直接检测青霉素G，需将其进行衍生化反应，降低其极性，才能用GC-MS/MS检测。由于不知衍生产物的极性大小，所以本试验采用盲摸原则（色谱柱极性由弱到强）和固定相相似性原则（固定相与待测物极性的相似性）进行操作。试验初期先采用实验室现有的非极性毛细管色谱柱TG-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，5%-二苯基-95%-二甲基硅氧烷），发现无法检测到未知衍生物，然后又参考Preu等在GC-MS检测牛肉中的青霉素G时，选用Rtx-1（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）非極性毛细管色谱柱 [11]，结果青霉素G峰形良好。综合来看，青霉素G衍生物极性很弱，需选用比TG-5MS极性还要低的毛细管色谱柱。本试验最终选择TG-1MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm，100%聚二甲基硅氧烷）毛细管色谱柱检测鹅肉中的青霉素G残留，发现青霉素G峰形更好，与Preu等报道的结果 [11]一致。这是因为TG-1MS为完全非极性毛细管色谱柱，惰性更高，可保证良好峰形和灵敏度，适用于难以分析的化合物;可降低基线噪声，提高信噪比;耐受温度可达330 ℃或350 ℃，高温操作时也不会出现柱流失。

3.2 衍生化试剂的选择与衍生产物的稳定性

衍生化试剂种类很多，包括甲硅烷基化试剂、酰化试剂、烷基化试剂及酯化试剂等。重氮甲烷是烷基化试剂中常用的甲基化试剂，主要将羧酸转化为甲酯（重氮链），然后通过GC-MS/MS进行测定。Preu等 [11]、伊冰 [13]都曾用重氮甲烷衍生青霉素G，前者采用的是GC-MS结合内标法，结果良好，后者是GC结合外标法，结果较差。虽然重氮甲烷与羧酸类化合物反应迅速，但需现用现配，否则会在色谱图中产生杂峰，且不易制备和分解较快，同时具有高毒性、热不稳定性和易爆炸性等性质 [14]。本试验也对此进行验证，最终效果不理想，得出重氮甲烷并不是实验室常用衍生试剂的最佳选择，需要找一个更安全、稳定的替代试剂。三甲基硅烷基重氮甲烷（TMSD）与重氮甲烷具有相同的衍生能力，而且TMSD具有无毒、安全、稳定的性质，更方便合成药物用于分析，也更适用于实验室操作。TMSD主要是通过用三甲基甲硅烷基取代一个氢来克服重氮甲烷的缺点 [15-16]。虽然TMSD是重氮甲烷的安全替代品，但用TMSD作为青霉素G的衍生化试剂目前尚未见报道，因此需验证TMSD能否与青霉素G发生反应。本试验首先将TMSD、青霉素G及二者的反应产物进行薄层色谱点板并在紫外分析仪下照射，观察是否发生反应，结果发现衍生产物的点处于最前端，证明有反应发生，然后用GC-MS/MS 测定分析;同时参考Presser等 [16]、Ranz等 [17]、Rompa等 [18]采用TMSD衍生羧酸类物质并用GC进行分析检测的方法，试验结果良好。故本试验最终采用GC-MS/MS结合外标法检测鹅肉中青霉素G残留，选择TMSD作为衍生化试剂，不需购买内标物，降低试验成本，无需现用现配，保存周期长且不易分解，缩短样品前处理过程，结果良好。综上所述，本试验选用TMSD作为衍生化试剂是最佳选择。此外，本试验对青霉素G衍生产物在24 h内的稳定性进行了研究，由图5可知，整体呈现稳定趋势，但8～12 h波动较大，可能与其反应是否充分有关，然后从12 h往后青霉素G衍生产物开始分解。因此，青霉素G衍生产物最好能在24 h内完成检测分析。

3.3 气相色谱和质谱参数的优化

本试验参照Preu等建立的方法 [11]，所得目标物的峰形不好，且出峰时间较长，约21.08 min，因此需要优化气相色谱参数。通过反复优化试验，所得目标物的峰形较好，且出峰时间大大缩短，最终筛选出气相色谱最佳条件为：初始温度100  ℃，1 min;

30 ℃/min升至220 ℃，1 min;30 ℃/min升至280 ℃，5 min。进样口温度：280 ℃;不分流进样模式;不分流时间：1.0 min;50.0 mL/min的分流流量;恒流模式;载气流速1.0 mL/min;2 min后开阀，载气节省2 min，载气节省20.0 mL/min流量;进样体积1.0 μL。

众所周知，未知化合物的定性主要是通过将目标化合物的标准品Full SCAN获得的质谱图与Nist谱库比对。由于青霉素G衍生产物质谱图在谱库中不存在，所以主要根据Preu等提出的质谱图和大量的预试验确定的目标物来进行优化试验 [11]。故本试验最终采用Full SCAN和SIM方式对青霉素G衍生物进行定性，扫描范围m/z 50～360（图1）;TSQ 8000采用Auto SRM方式进行定量扫描，选择m/z 174.1>91.1和m/z 174.1>142.1为定性离子对，m/z 174.1>114.1*为定量离子对，确保定性和定量结果的准确性。

4 結论

本试验优化并建立了鹅肉中青霉素G残留的GC-MS/MS检测方法。鹅肉中青霉素G回收率高于80.67%，LOD、LOQ分别为1.50、4.50 μg/kg。该检测方法灵敏度高、定性、定量准确，可满足鹅肉中青霉素G残留确证检测的要求。

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