食品中4，4’-二硝基均二苯脲残留量的 前处理方法比较

◎ 谭美龄，蒋忠岑

（重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000）

4，4’-二硝基均二苯脲（DNC）是抗球虫药尼卡巴嗪的残留标志物和抗球虫效果的主要活性成分[1]，长期摄入尼卡巴嗪含量超标的食品会对身体产生危害。本文分别采用Oasis®PRiME HLB固相萃取法[2]、国家标准方法GB/T 29690—2013[3]以及QuEChERS法[4]对鸡蛋和鸡肉进行前处理，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对DNC的残留量进行测定[5]。从净化效果、目标物损失情况、基质效应、回收率及精密度和实际应用能力这几个方面对DNC的3种前处理方法的适用性进行了比较，为尼卡巴嗪的相关分析研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋、鸡肉，采样于超市和农贸市场。

标准物质：DNC（Lot：C0005423，纯度为99.7%），北京曼哈格；DNC-D8（Lot：30213203，纯度为99.7%），德国WITEGA。

甲醇、乙腈（均为色谱纯），德国Merck公司；正己烷、无水硫酸钠等（均为国产分析纯），重庆川东化工公司；CNW®PSA（硅胶键合乙二胺基-N-丙基）、CNW®LC-C18（硅胶键合十八烷基40～63 μm），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

DIONEX UltiMate-3 000液相色谱系统-串联TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱仪（配ESI离子源），美国Thermo Fisher Scientific公司；SIGMA 3-15型台式高速离心机，德国SIGMA实验室离心机公司；Reeko AutoEVA-60全自动平行浓缩仪，睿科集团股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取DNC标准物质0.010 02 g置于10 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺溶解配制成DNC标准储备溶液（998.994 μg·mL-1）；称取 DNC-D8标准物质 0.010 00 g置50 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺配制成DNC-D8标准储备溶液（199.4 μg·mL-1）。分别移取上述溶液，用甲醇稀释成DNC标准工作溶液（998.994 ng·mL-1）和DNC-D8标准工作溶液（9.97 μg·mL-1）。按照最终定容内标浓度为 100 ng·mL-1，外标浓度为 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1、80 ng·mL-1和 100 ng·mL-1，采用 75% 甲醇水溶液进行稀释配制。

1.3.2 样品制备

（1）方法1。采用GB 29690—2013方法，其中加入 10 μL DNC-D8标准工作溶液（9.97 μg·mL-1），最终用75%甲醇水溶液复溶至1 mL。

（2）方法2。称取2 g样品，加入100 μL DNC-D8标准工作溶液（9.97 μg·mL-1）和10 mL 80%乙腈水溶液，涡旋混合1 min，超声10 min，8 000 r·min-1离心10 min。取4 mL上清液过Oasis®PRiME HLB（6 mL，200 mg）小柱，收集滤液并吸取1 mL于氮气下（＜40 ℃）吹至近干，将残余物用75%甲醇水溶液复溶至1 mL。

（3）方法3。称取2 g样品，加入4 mL水，涡旋混合1 min。加入100 μL DNC-D8标准工作溶液（9.97 μg·mL-1）和 10 mL 乙腈，涡旋混合 30 s。加入4 g硫酸镁（MgSO4）及陶瓷子，涡旋混合1 min，8 000 r·min-1离 心 10 min。 取 3 mL 上 清 液， 加 入400 mg MgSO4、70 mg PSA、20 mg C18，涡旋混合1 min，8 000 r·min-1离心 5 min。取 1 mL 上清液于氮气下（＜40 ℃）吹至近干，将残余物用75%甲醇水溶液复溶至1 mL。

1.3.3 仪器分析条件

色谱柱：XBridge®BEH C18 2.5 μm 2.1 mm×100 mm Column XP；流动相A：甲醇；流动相B：5 mmol·L-1乙酸铵水溶液；梯度洗脱：0～1 min，流动相A为20%并保持1～2 min，流动相A从20%线性增加至90%，并保持至6 min。6.0～6.1 min，流动相A从90%线性回至20%，并保持至8 min；流速：0.20 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：40 ℃

离子源：ESI-；检测方式：选择反应监测扫描（SRM）；电喷雾电压：-2 500 V；雾化器蒸发温度：300 ℃；毛细管温度：350 ℃；鞘气：241.32 kPa；辅助气：68.95 kPa；离子吹扫气：0 kPa；DNC定量离子对：300.991＞137.008，DNC定性离子对：300.991＞107.097；透镜电压：-24 V；碰撞能量：-22 V（定量）/-40 V（定性）；DNC-D8定量离子对：309.156＞141.020，透镜电压：-43 V；碰撞能量：-18 V。

2 结果与分析

2.1 净化效果

净化能力越强，杂质干扰越小。对于鸡蛋样品，净化效果为方法2＞方法3＞方法1；对于鸡肉，净化效果为方法3＞方法2＞方法1。方法1是国标方法，前处理采用乙腈提取的同时沉淀蛋白、正己烷脱脂净化，其提取液与正己烷分界面较浑浊，在目标化合物附近存在一定程度的色谱峰干扰，杂质容易污染色谱和质谱系统，除杂能力有限。方法2是采用80%乙腈水提取，PRiME HLB净化的方法，该法能有效去除鸡蛋、鸡肉中的蛋白、脂肪、磷脂和色素[2]。方法3是采用乙腈提取，PSA、C18分散固相萃取净化的方法，除杂能力优于方法1，样品提取液较清亮，但对于鸡蛋样品来说，除磷脂能力不及方法2。

2.2 目标物损失情况

采用3种方法分别处理加标样品溶液（1 ng·mL-1），目标物损失大小依次为方法2（33%）＞方法3（16%）＞方法1（14%）。方法2中PRiME HLB小柱的净化效果虽好，但是容易吸附DNC和DNC-D8，特别对于鸡蛋样品中目标物的吸附更明显，容易造成检出限偏高。方法3中QuEChERS法所用的提取盐和净化吸附剂对DNC及其内标物的存在一定的吸附，不及方法1中的国标方法检出限低。

2.3 基质效应

通过比较DNC在鸡蛋和鸡肉中的响应情况，考察基质效应，计算公式为：

3种方法的回收率、精密度和基质效应见表1。在3种不同方法处理条件下，鸡蛋和鸡肉均表现为弱基质增强效应（|ME|＜20%），对离子化的增强效果不明显[6]。其中，采用方法2处理鸡蛋所产生的基质效应最低，方法3处理鸡肉所产生的基质效应最低。

2.4 回收率及精密度

采用3种方法对鸡蛋和鸡肉进行加标回收试验[7]，见表1。方法2的回收率最低且不稳定，主要由于小柱填料对目标物的吸附影响太大；方法1的RSD均小于5%，稳定性最高；方法3的回收率在83.2%～96.8%，相比其他方法损失最小。

表1 3种方法的回收率、精密度和基质效应表

2.5 实际应用能力

本研究对100组鸡肉进行试验，见表2。3种方法的试剂使用量均不大，对环境和操作人员的影响较小，准确度和精密度均符合相关法规的要求。方法1采用有机试剂来提取加净化，一步到位，用时较短，成本最低。方法2的净化效果最好，色谱峰最干净，用时最短，但是回收率偏低，目标物损失较大，检出限偏高，实验成本较大。方法3耗时相对较长，但是回收率高且稳定，成本合适。

表2 3种方法的实际能力表

3 结论

综合3种方法对鸡肉和鸡蛋中4，4’-二硝基均二苯脲残留量的检测分析，3种方法各有所长，应结合具体实际情况来采用不同的前处理方法，达到相应的实验目的。方法1稳定性最好，检出限最低，成本最低，但净化效果略差，基质效应较大。方法2的净化效果最好，基质效应最弱，但方法回收率较低，稳定性较差，损失较大。方法3回收率最高，净化效果和稳定性较好。在保证检测结果准确性的基础上，为提高检测效率，降低成本，方法1和方法3更适合于实验室中大批量样品的快速定性定量分析。