中医药干预RA性骨病中Wnt/β-catenin信号通路的研究进展❋

王 钢， 周孟茹， 李平顺， 马鹏程

(1.甘肃中医药大学附属医院风湿骨病科，兰州 730000；2.兰州大学基础医学院，兰州 730000；3.甘肃中医药大学，兰州 730000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以进行性软骨破坏和骨侵蚀为特征的慢性疾病[1]。骨破坏或骨量丢失是RA的严重并发症，主要在于成骨细胞(osteoblast，OB)与破骨细胞(osteoclast，OC)关系失衡、OC的数量及功能亢进导致[2-3]。随着分子生物学发展，Wnt/β-catenin信号通路在RA性骨病干预中的核心作用得到公认，其对OB分化、生长、凋亡及功能表达具有重要意义。目前体内外实验和动物实验均证明，中医药可通过上调Wnt蛋白、β-catenin等关键性因子激活Wnt/β-catenin信号通路，进一步活化骨形成关键核因子Rnux2，促进OB分化，达到干预骨病目的。现将中医药通过Wnt/β-catenin信号通路干预RA性骨病的机制研究及其最新进展作如下述评。

1 RA性骨病的实质

《中西汇通医经精义》曰:“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也。髓者，发精所生，精足则髓足，髓在骨中，髓足则骨强。[4]”肾之精气盛衰，直接影响骨的功能与形态。痹证者脏腑功能失调、气血阴阳失衡，直接或间接影响骨的生长代谢而致骨病。现代医学中RA疾病特征是关节滑膜炎和血管翳的形成，可因免疫紊乱或遗传等因素使成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)活化、增殖并产生细胞因子和炎症趋化因子(如IL-1、IL-6、IL-17等)，导致OC异常激活和OB分化受抑，OC与OB关系失衡，骨侵蚀大于骨重塑，就会出现骨质破坏、骨质疏松等病理损伤[5]。因此，诸多学者通过RANKL-RANK-OPG信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/Ca+2信号通路、BMP信号通路等调控骨细胞分化进程对RA性骨病针对性防治，并取得理想效果，其中研究较多的是Wnt/β-catenin信号通路[6]。

2 Wnt/β-catenin信号通路的调控机理

图1示，Wnt信号通路于1982年由Nusse等首次报道，其包括依赖β-catenin的经典通路与不依赖β-catenin的非经典通路。Wnt/β-catenin信号通路又称Wnt经典信号通路，主要通过Wnt蛋白家族、β-catenin等[7]关键性因子激活Runx2等基因转录，参与胚胎发育期多种重要细胞生长进程的调控及器官的发育，尤其对OB的生长、分化与凋亡和骨形成具有重要意义。因此，β-catenin的磷酸化/稳定积累并精准入核是Wnt/β-catenin信号通路持续活化的基础[8]。

图1 Wnt/β-catenin信号通路图像[13]

Wnt/β-catenin信号通路由Wnt蛋白家族、膜受体、胞质复合物、核内转录因子、信号通路抑制剂、下游调控因子等大分子复合物组成，实现了由胞外到核内的信号传导，启动骨细胞靶基因转录，促进成骨分化。当胞外的Wnt蛋白与膜受体(由低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5，6和卷曲蛋白(Fz)家族组成)结合，活化散乱蛋白(Dvl)通过与Axin的直接作用，诱导胞质复合物(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)降解，抑制GSK-3β活性，减少β-catenin的磷酸化并使其在胞内稳定积累且精准入核，与转录因子(TCF/LEF)结合，调节靶基因(Runx2、Cbfa1等)的表达[9]。当胞外缺乏Wnt蛋白，β-catenin与Axin、APC、GSK3等形成降解复合物，促进β-catenin磷酸化，被E3泛素连接酶降解[10]。另外Wnt/β-catenin信号通路中还存在一些重要的负向调节因子，如抑制因子Dickkopf 1(DKK1)、硬化蛋白(sclerostin，SOST)和分泌型Fz相关蛋白(sFRP)等[11]。DKK1主要与LRP5结合进而抑制和降解胞内的四聚体；SOST可与Wnt蛋白竞争性结合LRP5，从而抑制其通路激活；sFRP可与Wnt蛋白形成稳定复合物，阻止其与膜受体结合[12]。

3 与RA性骨病干预相关的OB

骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力，在一定条件诱导下可分化为OB、软骨细胞等。OB是骨重塑的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化；碱性磷酸酶(ALP)与矿化结节可作为OB分化成熟的特征指标之一[14]。国内外研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中扮演着重要角色，而Wnt/β-catenin信号通路抑制结果主要在OC与OB、FLS中表现明显，导致OB分化受抑和凋亡程序启动，继发OC异常活化，促进骨质侵蚀和骨质疏松的发生发展[15]。

淫羊藿、骨碎补是临床治疗RA性骨病最为常用的单味中药。大量文献报道，淫羊藿及其活性成分淫羊藿苷可从基因、细胞分子等多水平影响OB的增殖分化，提高ALP活性，抑制凋亡，增强生物学功能[16]。郭英等[17]发现，骨碎补总黄酮可通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs向OB分化。另有研究证明，中药复方补肾活血颗粒含药血清能显著提高OB中ALP的活性，增加矿化结节数量[18]。壮骨止痛方(淫羊藿、补骨脂、狗脊、川牛膝等组成)[19]与清热活血方[20]均可激活Wnt/β-catenin信号通路，促进OB分化与成熟，调节OB和OC平衡，发挥骨保护作用，以减轻CIA大鼠骨质破坏。

4 与RA性骨病干预相关的OC

OB及骨髓基质细胞表面可表达核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)。RANKL首先激活OC前体细胞(OCPs)表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)受体并与之结合，从而将信号传给胞内，然后进一步级联激活下游各种由蛋白激酶介导的信号传导途径以诱导OC的形成、分化，增强骨吸收。OPG和RANK竞争性地与RANKL结合，减少RANK与RANKL结合，抑制OC分化成熟，诱导OC凋亡[21]。

根据肾主骨生髓理论，在RA性骨病的临床治疗中应用了大量补肾中药，部分研究[22]证实这一理论的正确性。补肾中药对骨细胞有正向调节作用，促进OB分化，同时抑制OC活化、增殖并启动凋亡程序，既可修复骨质又减轻骨质破坏。通过实验发现，槲皮苷[23]、雷公藤甲素[24]、(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇[25]均能抑制RANKL-RANK-OPG信号通路，降低RANKL/RANK/OPG比值，从而在RA治疗中发挥抑制OC生成和骨破坏缓解关节炎症作用。有研究表明，断藤益母汤对RA的骨破坏具有抑制作用，其机制之一可能是通过影响Wnt信号通路相关蛋白及DDK1蛋白表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制OC的分化与增殖[26]。

5 与RA性骨病干预相关的Wnt蛋白家族

Wnt蛋白家族由19种分泌性糖蛋白组成，其结构富含半胱氨酸，与棕榈酸酯形成难溶于水的共价化合物游离于胞外，在骨细胞分化与骨重建过程中发挥生物学作用。研究表明，Wntl、Wnt7b、Wnt10b等可影响OPG表达或OPGmRNA转录以促进成骨分化；而Wnt3a、Wnt4、Wnt5a和Wnt16等通过调控RANKL/OPG比率稳定骨细胞平衡关系[27]。Wnt/β-catenin信号通路Wnt蛋白配体主要包括wntl、wnt3、wnt3a、wnt7b、wnt8等[28]。Wntl可促进OB的分化和成熟并防止细胞的凋亡，主要机制是Wntl与膜受体结合，激活Wnt/β-catenin信号通路，增加β-catenin有效浓度，上调骨重塑相关基因Runx2及下游因子的表达水平，促进OB的分化、成熟；Wntl可抑制OB与骨细胞程序性凋亡，增加OB的数量与活性[29]。Wnt3通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进OB的增殖、分化和成熟，同时也能活化非经典Wnt/JNK信号通路，抑制OC的数量与功能[30]；Wnt3a刺激Wnt/β-catenin信号通路上调OB的OPG表达，竞争性地抑制RANKL与RANK结合，抑制OCPs的分化[31]。

目前对于中医药直接调节Wnt1、wnt8蛋白干预RA性骨病的研究较少，主要是集中于其下游因子β-catenin蛋白，而通过调节Wnt3、wnt3a、wnt7b 蛋白干预骨病的研究比较热门。研究报道，维药买朱尼[32]可减少炎性细胞趋化因子，抑制炎性细胞聚集与活化，同时上调Wnt3a、β-catenin的表达，抑制OC功能。鞠大宏等[33]认为，激素性OP主要因OB中Wnt3a等蛋白和其mRNA的表达下调导致，左归丸能通过上调Wnt3a及其mRNA的表达防治骨病。秦梦等[34]研究发现，右归丸也可上调Wnt3a、wnt7b 蛋白表达水平，促进OB的增殖、矿化及抑制OC活性，起到干预骨病作用。

6 与RA性骨病干预相关的膜受体

膜受体由低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)和卷曲蛋白(Fz)组成。LRP5/6属于LRP家族成员，为单次跨膜蛋白，其中LRP5为辅助受体[35]。通过与Wnt-Fz复合物的脂质成分结合，启动Wnt/β-catenin信号通路；Fz是细胞表面特异性跨膜蛋白，N端富含半胱氨酸能与Wnt蛋白特异性结合[36]，胞内与蓬乱蛋白作用，稳定胞质复合物，抑制β-catenin降解，与LRP5/6共同作用完成信号传导。

刘梅洁[37]等在骨质疏松机制研究中表明，激素可降低OB中Wnt3a、LRP-6、β-atenin和其mRNA的表达，而滋补肾阴法的代表方左归丸，可上调LRP-6等信号通路活化关键因子的表达以防治OP。许应星等[18]研究表明，补肾活血颗粒含药血清能显著增加OB中ALP、LRP5的表达，并促进矿化结节的形成。另外研究显示，牛膝多肽[38]、补骨脂素[39]、龙须藤多肽[40]能上调Fz，从而激活Wnt/β-catenin信号通路。

7 与RA性骨病干预相关的胞质复合物

胞质复合物是由Axin、APC、GSK-3β、β-catenin组成的四聚体。Axin是中心分子，N端RSG区域、C端DIX区域分别与APC、散乱蛋白特异性结合，中间包裹β-catenin形成胞质复合物。当Wnt蛋白与膜受体结合后，通过与散乱蛋白作用，Axin被征募到细胞膜，与LRP5辅助受体结合抑制GSK-3β活性，β-catenin释放入核完成信号传导[41]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是一种丝氨酸(S)/苏氨酸(T)激酶，通过磷酸化β-catenin末端的3个丝氨酸/苏氨酸(S33、S37、T41)，促进β-catenin被特定的泛素酶系统识别而被降解[42]。β-catenin是一类在Wnt/β-catenin信号通路中发挥枢纽作用的多功能蛋白，大量实验证明，β-catenin是影响Runx2基因转录的关键因素，低浓度β-catenin可抑制间质细胞Runx2基因的表达，从而抑制间质细胞的成骨分化；若β-catenin基因缺失，导致RANKL/RANK/OPG失衡及相关受体功能改变，会影响OC的生成[43]。

GSK-3β、β-catenin蛋白活性与浓度是Wnt/β-catenin信号通路激活的关键因素。有研究报道，黄连小檗碱[44]对GSK-3β水平有明显的调节作用；黄芩苷[45]、牛膝多肽[38]、补骨脂素[39]、龙须藤多肽[40]可上调β-catenin，促进GSK-3β磷酸化，保证β-catenin入核传递信号，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进骨质修复。另外在中药复方对OB增殖活性研究中发现，右归丸[46]、壮骨止痛方[19]、断藤益母汤[26]均可使β-catenin蛋白表达明显增多，GSK-3β蛋白表达减少，说明以上方剂改善骨骼质量的作用机制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进OB分化与成熟从而防治骨病。

8 与RA性骨病干预相关的核内因子-Runx2/Cbfa1

Runx2是Runt结构域基因家族成员之一，是成骨分化特异性转录因子，通过调控成骨标志基因的转录，从而促进OB分化。目前发现，Runx2能调控成骨标志基因包括骨钙素、I型胶原、骨涎蛋白和骨桥蛋白等；除此之外，Runx2能够影响ALP的活性和OB的矿化等[47]。Runx2与Cbfa1分布在OB中，主要通过早期诱导OB的分化和后期抑制OB凋亡等机制，促进多功能间质干细胞向OB分化[48]。

中药淫羊藿是一种骨破坏修复的常用药，研究显示[49]淫羊藿能够上调骨髓基质干细胞Cbfa1的表达，促进OB分化增殖，为中药干预骨病提供了组织细胞和分子生物学基础证据。高璐等[50]研究发现，补肾中药淫羊藿、补骨脂、女贞子、何首乌有效成分配伍能提高骨髓间充质干细胞增殖率，促进骨髓间充质干细胞分化为OB，其机制与上调Runx2、OSX的基因表达相关。胡流超等[51]通过慢病毒载体介导Runx2基因沉默，使大鼠骨质疏松骨折愈合延缓，补肾活血汤能上调Runx2/Osterix表达，逆转Runx2基因沉默的效应，具有明显促进骨折愈合的作用，对骨质疏松性骨折具有良好的治疗效果。

9 与RA性骨病干预相关信号通路抑制剂-DKK1

DKK1是Wnt/β-catenin信号通路的一个负调控蛋白，通过钝化LRP5/6，阻止Wnt3a-Frz-LRP复合物的形成，封闭Wnt/β-catenin信号通路[52]，阻断早期OB形成并诱导未成熟的OB凋亡。研究发现，在RA患者被侵蚀的关节中，DKK1过度表达且促炎因子TNF-α明显增多(TNF-α可进一步诱导DKK1活化)，通过抑制OB数量与功能阻止骨重建[53]。

研究报道，活血化瘀中药可以通过下调DKK1及其骨重建基因，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而影响OB的分化，促进骨折愈合[22]。吴海华[54]等在OA大鼠模型中发现，DKK1在OA组的表达显著高于正常组，且DKK1含量与病程呈正比关系，消骨痛汤通过抑制DKK1的表达，缓解病情进展。

10 与RA性骨病干预相关的下游调控因子-BMP2

BMP2属于转化生长因子β超家族，对OB增殖分化与骨质修复过程有重要意义，可通过提高LRP5的表达促使与Wnt蛋白结合；或通过促进β-catenin基因表达和蛋白合成，抑制β-catenin磷酸化，激活Wnt/β-catenin信号通路，促使BMSC成骨分化[14]。

在骨碎补总黄酮对骨质疏松疗效研究中发现，骨碎补总黄酮组大鼠股骨组织的骨小梁数量、密度、布局及完整性均优于其余各组，其机制可能是通过上调股骨组织中BMP-2蛋白和血清中的骨钙素水平，促进大鼠BMSC向OB分化，进而促进骨的形成[55]。研究发现，淫羊藿素(ICT)有类雌激素(ER)活性作用，可促进OB株增殖、分化，主要因为ICT剂量依赖性地提高BMP-2的表达；而阻断ER受体信号后，ICT促OB分化作用明显下降[56]。另有报道，活血化瘀利水消肿方能提高骨组织中BMP-2的含量，促进OB的生成，增强骨组织强度、韧性[57]。

11 展望

“肾-髓-骨”一体论是RA性骨病的理论基础，其变在骨，其本在肾，肝肾亏虚、气血不足、骨骼失养终为骨病。从查阅整理文献过程中就得出，无论是单味药或者中药复方，其性味、归经都集中于肝肾，并与气血阴阳有关，最终作用于骨。大量文献表明，中医药通过激活Wnt/β-catenin信号通路干预RA性骨病的发生发展，具体机制是通过上调或者下调其过程中的蛋白、因子的转录，从而影响OB、OC的发育分化，促进骨基质的形成和矿化，抑制骨量丢失。随着分子生物学发展，中医药通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预RA性骨病机制方面有了一定发展，为中医药干预RA性骨病提供了大量潜在的作用靶点，同时也为各调控因子的单克隆抗体研发提供了实验基础。

尽管此类研究越来越多，但仍存在一些问题：(1)在药理、药效学方面的研究多局限于单味中药，但中药单味药和复方药作用条件与成分复杂，有效成分难以分离提取，当前的研究仅仅是部分机制，缺乏其代谢产物具体的作用靶点及作用机制，对准确作用剂量的量效把控研究不足，这也可能是以后的发展方向；(2)对于不同疾病，相同中医药可激活亦可抑制Wnt/β-catenin信号通路，如补肾活血中药干预RA性骨病通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进OB成骨作用；干预骨性关节炎通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥保护关节软骨，缓解疼痛的效果；这有可能说明中医药对该通路可能有双向调节作用，但其理论还有待进一步的研究；(3)文献评价Wnt/β-catenin信号通路中核内转录因子较少，中医药可直接促进间质干细胞成骨分化，是否也通过调控Runx2表达，间接促进间质干细胞成骨分化；或者中医药可上调β-catenin蛋白，但不能充分证明β-catenin是否入核以激活Wnt/β-catenin信号通路，此类问题有待于进一步研究。