以红芸豆与黄豆为氮源的枯草芽孢杆菌液态发酵代谢组学比较分析

高安平，龚爱华

（江苏省太仓市疾病预防控制中心，江苏 太仓 215400）

0 引言

纳豆通常以黄豆为原料，经枯草芽孢杆菌在适宜条件下发酵制成的豆制品，其有效成分纳豆激酶（Nattokinase，简称NK），是在发酵过程中由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的丝氨酸蛋白酶，能特异性水解纤维蛋白，从而溶解血栓[1]。

目前，纳豆激酶主要使用黄豆作为氮源来生产，但黄豆培养基发酵产物中嘌呤含量高，限制了痛风患者的使用。为此，本研究以红芸豆为培养基氮源，使用代谢组学方法，比较分析红芸豆培养基与黄豆培养基经枯草芽孢杆菌发酵后代谢产物的差异。

1 材料与方法

1.1 菌种与材料。菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为江苏大学医学院肿瘤转化医学实验室分离，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14434；材料：红芸豆及黄豆，市售；纤维蛋白原、凝血酶（2000 U/mg）购于沈阳拜英生物技术有限公司；尿激酶标准品（1240IU/瓶）购于中国食品药品检定研究院；氯化钠、磷酸二氢钾、NaOH等试剂为分析纯；乙腈、异丙醇、甲酸为色谱纯。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制：LB液体培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母粉1%，PH 7.0。LB固体培养基：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母粉1%，琼脂粉2%，PH 7.0。红芸豆发酵培养基：红芸豆粉2%，葡萄糖4%，氯化钠1.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，pH值为7.0，均为w/v。黄豆发酵培养基：黄豆粉2%，葡萄糖4%，氯化钠1.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，pH值为7.0，均为w/v。以上培养基均经121℃高压灭菌20 min。

1.2.2 种子液制备：菌种活化：取30μL保存于-80℃的甘油菌接种于3 mL LB液体培养基，37℃，225rpm，培养6 h。四区划线接种LB固体培养基，37℃培养15h，挑取单菌落，接种3 mL LB液体培养基，37℃，225rpm培养6 h，得菌种子液。

1.2.3 粗酶液制备：将种子液接种到pH值为7.0的发酵培养基中，接种量2%，在37℃，225rpm的条件进行发酵，第72 h取样检测。

1.2.4 纳豆激酶活性检测：纳豆激酶活性采用纤维蛋白平板法进行检测，该方法于1952年由Astrup等人建立[2]。具体操作如下：将200μL纤维蛋白原溶液与60μL凝血酶溶液加入30 mL琼脂糖溶液（1%）中，充分混匀，倒入平板，室温放置1 h，形成纤维蛋白凝块；用打孔器在纤维蛋白板上打孔，每孔加酶液10μL，置于37℃反应15 h，取出后测定各溶解圈的垂直两直径，计算溶圈面积。以尿激酶的溶圈面积为横坐标，尿激酶浓度为纵坐标，制作尿激酶酶活性标准曲线，根据标准曲线及稀释倍数求出样品的酶活力大小。

1.2.5 嘌呤含量检测：样品制备：发酵结束后，收集发酵液于离心管中，12000 g离心10 min，取上清，经冻干机冻干，即制得样品。称取一定量样品于10 mL离心管，加2 mL+3.0%高氯酸溶液，快速混匀，100℃水浴60 min，冷却后，使用2M氢氧化钾调pH至7.0，再使用5.0%甲酸调pH至3.6，使用10 mm甲酸铵溶液（pH3.6）定容至10 mL，混匀，过0.22μm滤膜后待测。色谱条件：色谱柱为Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm×5μm）；柱温：30℃；流动相：10 mm甲酸铵（pH3.6）和甲醇（99%∶1%）；进样量：10μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm。

1.2.6 代谢组学分析：样品制备：发酵结束后，收集发酵液于离心管，12000 g离心10 min，取上清，冻干机冻干，即制得样品。称取50 mg样品至5 mL离心管中，加入一颗直径6 mm的研磨珠；加入400μL提取液（甲醇：水=4∶1（v∶v）），使用冷冻组织研磨仪研磨6 min（-l0℃，50 Hz）；低温超声提取30 min（5℃，40 KHz），样品静置于-20℃，30 min；离心15 min（12000 g，4℃），取上清液上机分析。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，l.8μm；Waters，Milford，USA）；流动相A为95%水+5%乙腈（含0.1% 甲酸），流动相B 为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（含0.1% 甲酸）；流速为0.40 mL/min，进样量为2μL，柱温为40℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。

2 结果

2.1 红芸豆培养基发酵代谢物中纳豆激酶活性高。分别取1 mL红芸豆与黄豆发酵液于1.5 mLEP管中，12000 g离心5 min取上清，检测到纳豆激酶活性分别为13340 U/mL和9772 U/mL，红芸豆发酵代谢产物中的纳豆激酶活性显著高于黄豆发酵代谢产物中的纳豆激酶活性。如图1所示。

图1 红芸豆培养基与黄豆培养基发酵代谢物纳豆激酶活性比较

2.2 红芸豆培养基发酵代谢物中嘌呤含量极低。经检测，红芸豆培养基发酵代谢物嘌呤含量仅为4.17 mg/100 g，为低嘌呤产品，适用于痛风患者。黄豆为氮源生产的纳豆激酶中嘌呤含量报道为110.4 mg/100 g[3]。如图2所示。

图2 红芸豆培养基与黄豆培养基发酵代谢物嘌呤含量检测

2.3 红芸豆培养基与黄豆发酵培养基发酵代谢物差异较大。收集质谱信号绘制Venn图，阴离子模式下，红芸豆培养基与黄豆培养基发酵产物中共有62种差异代谢物，阳离子模式下共有24种差异代谢物（图3A）。红芸豆培养基的差异代谢物主要包含了含氧有机化合物、孕烯醇酮脂类及黄酮类物质，黄豆培养基的差异代谢物主要包含了类固醇类物质及其衍生物、脂肪酸、羧酸及其衍生物（图3B）。

图3 红芸豆培养基与黄豆培养基发酵代谢物差异分析

2.4 红芸豆培养基发酵代谢物中富含更多有益成分。对差异代谢物进行代谢物聚类分析，如图4所示。本研究选取了表达丰度前50的数据，相较于黄豆培养基，发酵后红芸豆培养基中共有30种代谢物含量较高，包括：圣草苷、透明质酸、儿茶素、谷胱甘肽及三萜类化合物。发酵后的黄豆培养基中共有20种代谢物含量较高，主要为类固醇物质与脂肪酸。

图4 红芸豆培养基与黄豆培养基发酵代谢物聚类分析

3 讨论

纳豆激酶作为一款安全有效的溶栓产品已广泛使用，但由于用黄豆生产出的产品中嘌呤含量为110.4 mg/100 g，限制了痛风患者的使用[4]。

本研究使用红芸豆为氮源生产纳豆激酶，其中嘌呤含量降至4.17 mg/100 g，活性提高为13340 U/mL。此外，相较于黄豆，以红芸豆为氮源代谢物中富含透明质酸、儿茶素、谷胱甘肽、三萜类化合物，对维持人体健康具有更加积极的作用[5-6]。

4 结论

本研究通过比较红芸豆培养基与黄豆培养基发酵产物中纳豆激酶活性、嘌呤含量以及代谢组学分析，首次证明了红芸豆是优于黄豆的纳豆激酶生产原料，为使用红芸豆为原料生产纳豆激酶提供了有力的依据。