miR-209下调MEK/ERK信号通路抑制胶质瘤U87细胞增殖、增强放疗敏感性的研究

杨彬 于晶 刘晓智 陈镭

天津市第五中心医院神经外科（天津300450）

脑胶质瘤是中枢神经系统原发肿瘤之一［1］，恶性胶质瘤具有高度侵袭、增殖能力强的特点，常规手术加术后辅助放疗能降低部分脑胶质瘤复发率，提高生存率［2］，但仍有研究报道常规手术加外放疗在原发灶周围局部复发，导致放疗失败［3］，提高胶质瘤的放疗敏感性是目前胶质瘤治疗研究的重点。miRNA 是一类长度大约20～25 个核苷酸非编码RNA［4］，通过与靶基因3′-UTR 结合调控多种疾病的发生发展［5］，多项研究证实miR-200家族成员影响脑胶质瘤的发生发展，本研究通过Real-time PCR 法检测miR-200 家族成员中的miR-209、MEK/ERK 在胶质瘤U87 细胞中的表达，研究miR-209 对胶质瘤U87 细胞的增殖和放疗敏感性的影响，初步探讨miR-209 以及MEK/ERK 信号在胶质瘤放疗抵抗中的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象胶质瘤U87 细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器荧光实时定量PCR 试剂盒（TaKaRa，日本），鼠抗人MEK/ERK 抗体（Abcam 公司，美国），LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国），DMEM 细胞培养基，青霉素/链霉素双抗试剂，10%胎牛血清，0.25%胰蛋白酶、CCK-8 试剂盒均购自自南京凯基生物公司，RIPA 蛋白裂解液（江苏碧云天公司），miR-209、MEK、ERK、miR-209 mimics 引物序列由杭州四季青生物工程有限公司（表1）。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene

1.3 实验方法

1.3.1 Real-time PCR 检测放疗后胶质瘤U87 细胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表达细胞培养：DMEM 完全培养基培养胶质瘤U87 细胞，加10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L，培养条件：5%CO2、温度37 ℃，湿度为95%。收集对数生长期的胶质瘤U87 细胞，使用6MV X 线照射，照射剂量8 Gy，TRIzol法提取细胞内总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，miR-209、MEK、ERK引物序列为模板，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环，根据公式Folds=2-△△Ct来计算目的基因的相对表达量，其中△△Ct=（Ct检测基因-Ctβ-actin）实验组-（Ct检测基因-Ctβ-actin）对照组。

1.3.2 转染miR-209 对胶质瘤U87 细胞增殖、放疗敏感性的影响收集对数生长期的胶质瘤U87细胞，取miR-209 mimics 100 pmol 与Lipofectamine 10 μL充分混匀，室温孵育1 h，放入培养箱中与胶质瘤U87 细胞培养24 h，使用6MV X 线照射，照射剂量8 Gy，TRIzol 法提取细胞内总RNA，Real-time PCR检测细胞内miR-209、MEK、ERK mRNA的表达；另取上述细胞，RIPA 裂解细胞，提取细胞总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测p-MEK（抗体1∶100 稀释）、p-ERK 蛋白（抗体1∶2 500 稀释）的表达；CCK-8 法检测miR-209 转染对8 Gy 放疗后胶质瘤U87 细胞增殖的影响：另取转染miR-209、放疗后胶质瘤U87 细胞，按照CCK-8 试剂盒说明加入试剂，培养24、48 h 后在酶联免疫检测仪450 nm 波长处测定每孔光密度（OD）值；另取mimics control 作为阴性对照组，照射后胶质瘤U87 细胞做空白对照组，每组实验重复3 次。

1.4 统计方法采用SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析，计量资料采用（）表示，两组间数据分析采用t检验；两组以上数据采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗后胶质瘤U87细胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表达放疗后胶质瘤U87 细胞中miR-209相对表达量为（0.09±0.02），低于放疗前的（0.15±0.05），差异有统计学意义（t=2.491，P=0.037 4）。放疗后胶质瘤U87 细胞中MEK mRNA 相对表达量为（0.38±0.11），低于放疗前的（0.45±0.14），但差异无统计学意义（t= 0.879，P= 0.405 0）。相比于放疗前ERK mRNA 的相对表达（0.36±0.09），放疗后ERK mRNA 相对表达量为（0.27±0.09），差异无统计学意义（t=1.581，P=0.152 5，图1）。

图1 放疗后胶质瘤U87 细胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表达Fig.1 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 after radiotherapy

2.2 转染miR-209 对胶质瘤U87 细胞增殖、放疗敏感性的影响miR-209 mimics 转染U87 细胞后，miR-209相对表达高达（7.44±1.58），高于阴性对照组（0.10±0.03）和空白对照组（0.08±0.02），差异有统计学意义（F=106.5，P＜0.000 1），表明miR-209已成功转染至U87 细胞内。miR-209 mimics 转染后，MEK mRNA 表达减少至（0.11±0.05），与阴性对照组（0.40±0.18）和空白对照组（0.42 ± 0.15）差异有统计学意义（F=7.866，P=0.006 6），ERK mRNA表达减少，与其余两组比较差异均有统计学意义（F= 9.891，P= 0.002 9，图2）。miR-209 mimics 转染U87 细胞后，p-MEK、p-ERK 表达均低于阴性对照组和空白对照组（图3）。miR-209 mimics 转染24、48 h，细胞增殖受到抑制，与阴性对照组和空白对照组比较均有统计学差异（F= 21.58，P＜0.000 1，图4）。

图2 miR-209 mimics 转染胶质瘤U87 细胞经放疗后miR-209、MEK、ERK mRNA 的表达Fig.2 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

图3 miR-209 mimics 后胶质瘤U87 细胞中miR-209、MEK、ERK 蛋白的表达Fig.3 The protein expression of MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

图4 miR-209 mimics 抑制胶质瘤U87 细胞增殖Fig.4 miR-209 mimics inhibit proliferation of glioma cell line U87

3 讨论

胶质瘤是神经外科常见的肿瘤，其中胶质母细胞瘤在WHO 的分级中属于高级别胶质瘤，具有高度增殖、侵袭的特点［6］，预期寿命不超过1年，5年生存率不足4%［7］。以手术为主、联合放化疗的综合治疗是目前胶质瘤主要治疗方法［8］，但大部分患者手术难以完整切除，加之血脑屏障阻碍使得抗胶质瘤药物在局部很难达到有效浓度［9］，而术后辅助放疗可降低胶质瘤的复发率，延长生存期，是胶质瘤患者术后重要治疗手段［10］。随着放疗剂量的累积，胶质瘤细胞出现损伤修复、细胞周期的再分布等原因使部分胶质瘤患者出现放疗抵抗现象［11］，因此放疗耐受机制的研究是目前胶质瘤高放疗研究的重点。有研究发现多种基因、信号通路与放疗抵抗密切相关［12］。

大量研究报道丝裂原细胞外信号调节激酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）异常活化促进肿瘤发生发展，并与肿瘤化疗耐药、放疗抵抗密切相关［13］。MEKERK 信号通路通过细胞表面受体信号传导至细胞核内，参与多种病理过程，受上游RAS 癌基因家族调控，Ras 被刺激因子激活后，生长因子受体结合蛋白2（Grb2），作为接头分子，与SOS（son of sevenless）的C 端富于脯氨酸的序列相互作用形成受体-Grb2-SOS 复合物，在Ras 附近形成高浓度的SOS，激活Ras，从而激活Ras-MEK-ERK 信号通路［14-15］。本研究发现，X 线照射胶质瘤U87 细胞后，MEK、ERK mRNA 表达没有明显变化，表明放疗并不能刺激Ras-MEK-ERK 信号通路，亦或是胶质瘤U87细胞凋亡与Ras-MEK-ERK 信号通路激活共同作用结果，但miR-209 表达减少，通过瞬时转染使胶质瘤U87 细胞内过表达miR-209 后，细胞的增殖明显受到抑制，同时细胞内MEK、ERK 的转录和表达均明显降低，表明miR-209 可能通过下调MEK-ERK信号通路增强胶质瘤U87 细胞放疗敏感性，本实验初步阐明脑胶质瘤U87 细胞内过表达miR-209对放疗后细胞增殖的影响，表明微小microRNA 可能具有影响胶质瘤的放疗敏感性的作用，但其具体机制仍待进一步研究探索，本研究为后续脑胶质瘤的后续临床研究提供理论基础。

综上所述，miR-209 通过下调胶质瘤U87 细胞中MEK-ERK 的表达，能抑制细胞增殖，增强放疗敏感性，为胶质瘤放疗抵抗的机制研究提供新方向，同时为胶质瘤的综合治疗提供新的理论依据。