腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究△

徐世民，王炳武，张晓霞，刘伟强，于明东，苏保辉，高加智

（山东省潍坊市人民医院脊柱外科，261041）

腰椎间盘退行性病变（lumbar degenerative dis⁃ease,LDD）是临床常见疾病，它是由腰椎间盘的生理结构退行性病变引起腰椎间盘突出、椎管狭窄等病理改变，导致患者出现腰痛、下肢麻木、大小便障碍等临床症状［1］。据统计，全球每年有2.66亿人患有LDD，发病率为3.63%［2］，超过一半的人在生活中会受到腰背痛的影响［3］。随着对腰椎间盘退变认识的进展，包括影像学检查和干预试验等被应用到不同的方面，以推测LDD的病因［4，5］。腰椎间盘的退变具有很强的遗传性，细胞行为和细胞外基质的结构是否完整均由遗传信息所决定［6］。因此，本研究从此角度出发，探讨LDD与TRAIL基因之间的相关性及TRAIL基因的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

腰椎间盘髓核取自人体。其中，2019年7月—2020年7月手术治疗的腰椎间盘突出症60例患者为退变组，男32例，女28例，年龄32～64岁；同期因腰椎创伤手术，但椎间盘无退变的60例患者为未退变组，男49例，女11例，年龄26～57岁。将取出的髓核分成两部分，一部分用于制作石蜡切片，一部分用于髓核细胞的分离培养。本研究已预先通过本院伦理委员会批准并书面同意，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 组织化学染色

1.2.1 染色

髓核组织固定、脱水、浸蜡后制备蜡块，切5μ的石蜡切片。切片脱蜡、复水后行组化染色。

Tunel（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法检测细胞凋亡，用50 μl末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和450 μl地高辛标记的dUTP液混匀，而阴性对照组仅加50 μl地高辛标记的dUTP液，阳性对照组先加入100 μl DNase1，15～25℃反应10 min，后面步骤同处理组。玻片干后，加50 μl TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃反应1 h。加3%BSA室温作用20 min后，分别在3%BSA和50 μl POD转换液中孵育30 min，并加入DAB底物。苏木素复染后梯度酒精脱水。镜下观察凋亡细胞，细胞核内有黑棕色颗粒的为阳性细胞。

1.2.2 免疫组化

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）免疫组化染色，采用DAB法，复水，消除内源性过氧化物酶活性，加入一抗TRAIL，4℃过夜，加入生物素标记的二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。镜下见TRAIL阴性的细胞胞浆染色呈浅蓝色，而阳性的细胞呈现胞膜褶皱，着色较深，且细胞浆出现黄色颗粒样物质。

1.3 体外试验

1.3.1 细胞分离与培养

将退变髓核有消化酶消化后，用10%胎牛血清（美国Invitrogen公司）的DMEM培养基（美国Gibco公司）进行沉淀，记为原代（P0）。加入0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司）2 ml，当细胞突起回缩、变圆、细胞间隙变大，按1∶4传代接种到新的培养皿中，细胞计数并调整细胞密度。

1.3.2 细胞体外分组与处理

P1细胞分为4组，分别为空白对照组（control组）、TRAIL-siRNA转染组（siTRAIL组）、TNF-α处理组（TNF-α组）和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组（TNF-α+siTRAIL组）。

空白对照组：细胞常规培养，不行其它干预。

TRAIL-siRNA转染组：将髓核细胞用0.25%胰蛋白酶消化并计数后接种于6孔板，以DMEM培养基稀释 10 μl Lipofectamine 2000～250 μl，加入 0.05 nmol的TRAIL siRNA至250 μl DMEM培养基，终浓度为200 nmol/L。1×PBS缓冲液冲洗采用荧光定量PCR检测髓核细胞中TRAIL的表达，以确定转染效率。

TNF-α处理组：细胞接种于6孔板，加入浓度为100 ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培养基，持续培养2 d。

TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组：将髓核细胞用浓度为100 ng/ml的TNF-α处理，培养2 d后，用0.25%胰蛋白酶消化并计数后接种于6孔板，加入Li⁃pofectamine 2000和TRAIL siRNA DMEM培养基，终浓度为200 nmol/L。1×PBS缓冲液冲洗采用荧光定量PCR检测髓核细胞中TRAIL的表达，以确定转染效率。

1.3.3检测指标

MTT细胞增殖检测：将细胞以每孔5×103个细胞接种到培养板。培养48 h后，加新鲜配置的MTT溶液 （5 mg/ml） 20 μl/孔，继续孵育 4 h。上清液吸除，每孔中加150 μl DMSO，室温，摇床振荡10 min。490 nm波长，测定各孔光吸收值。

流式细胞检测:将贴壁细胞用标记溶液FITCAnnexin V和PI溶液标记，使用BD FACSAria流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）检测。在散点图上，正常的活细胞显示在左下象限，不被FITC-An⁃nexin V和PI染色，即FITC-/PI-；凋亡早期的细胞显示在右下象限，它仅被FITC-Annexin V染色，即FITC+/PI-；凋亡晚期和坏死的细胞显示在右上象限，它们既可以被FITC-Annexin V染色又可以被PI染色，即FITC+/PI+。

Western blot检测：P1细胞提取的组织蛋白与5×SDS上样充分搅匀，将蛋白加热变性后，用SDS聚丙烯酰胺（美国Amresco公司）凝胶电泳，丽春红染色后，剪出目的蛋白条带。加入二抗溶液和ECL化学发光试剂混合，在Biorad凝胶成像系统中曝光，观察蛋白条带情况并拍照。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 髓核组织化学检测

两组髓核Tunel组化染色结果见图1a，1b。退变组髓核内细胞稀疏，可见染色质边集化的TUNEL染色阳性细胞，呈黑棕色（图1a），而未退变组腰椎间盘内髓核细胞数量较多，呈蓝色，散在分布少许的TUNEL染色阳性细胞（图1b）。退变组中凋亡阳性细胞率为48.92%，末退变组中凋亡阳性细胞率为5.23%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

TRAIL免疫组化染色见图1c，1d，退变组TRAIL阳性细胞多见，呈现胞膜褶皱，着色较深，胞浆出现黄色颗粒样物质（图1c）。未退变组TRAIL阳性细胞较少，而阴性细胞多见，胞浆染色呈浅蓝（图1d）。

图1 组织化学染色结果（×400） 1a:退变组Tunel染色，髓核细胞减少，可见较多Tunel染色阳性（黑棕色） 1b:未退变组Tunel染色，可见大量髓核细胞，呈蓝色，散布少许Tunel阳性细胞 1c:退变组TRAIL染色，可见较多TRAIL阳性细胞，细胞呈现胞膜褶皱，着色较深，且细胞浆出现黄色颗粒样物质 1d:未退变组TRAIL染色，以TRAIL阴性细胞为主，胞浆染色呈浅蓝色

退变组TRAIL阳性率为49.11%，未退变组TRAIL阳性率为12.25%，两组间的差异有统计学意义（P<0.05）。

Pearson相关分析表明，髓核细胞的TRAIL阳性率与TUNEL凋亡细胞阳性率之间呈正相关（r=0.917，P<0.001）。

2.2 体外试验结果

2.2.1 MTT检测

将TRAIL-siRNA转染至退变髓核细胞中，用100 ng/mL的TNF-α处理转染或未转染的髓核细胞，然后MTT法检测细胞增殖情况，结果见图2。相较于空白对照组，TRAIL-siRNA转染组细胞的生长速度（100.75±5.72）%，差异无统计学意义（P>0.05），TNF-α处理细胞的增殖速度为（49.19±2.89）%，显著降低且差异有统计学意义（P<0.05），而TRAIL-siRNA转染+TNF-α处理组细胞的活性无明显变化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表达能显著改善TNF-α诱导的细胞活性抑制。

图2 siRNA沉默TRAIL表达对退变髓核细胞活性的影响，*与对照组相比，P<0.05

2.2.2 流式细胞检测

采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果见图3。相较于未转染细胞，TRAIL-siRNA转染退变髓核细胞凋亡无明显改变（P>0.05），TNF-α处理组细胞的凋亡率明显升高（P<0.05）。TRAIL-siR⁃NA转染+TNF-α处理组细胞的凋亡率较未转染组显著增加（P<0.05），但较TNF-α处理组显著降低，提示沉默TRAIL的表达可抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。

图3 siRNA沉默TRAIL表达对退变髓核细胞凋亡的影响

2.2.3 Caspase-3的Western blot检测

采用分光光度法Western blot检测退变髓核细胞中Caspase-3活性和表达情况，结果见图4。相较于未转染细胞，TRAIL-siRNA转染组退变髓核细胞中Caspase-3活性和表达无明显变化（P>0.05），TNF-α处理组细胞中Caspase-3的活性和表达明显升高（P<0.05），而TRAIL-siRNA转染+TNF-α处理组细胞Caspase-3的活性和表达无明显变化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表达可抑制TNF-α诱导的Cas⁃pase-3激活和表达。

图4 siRNA沉默TRAIL表达对退变髓核细胞中Caspase-3活性和表达的影响

3 讨论

腰椎间盘在特定范围内有着较好耐受性，而负荷超过一定程度就会对椎间盘发生结构的改变，进而出现椎间盘退变［7］。目前LDD的治疗方法有药物治疗（如非甾体抗炎药）、物理治疗和手术治疗、改善椎间盘变性的药物治疗、椎间盘变性的生物治疗以及干细胞治疗［8，9］。既往研究已认识到老化与退化的过程类似，但仍未明确两者之间的具体关系。

细胞生理状态的改变可导致细胞凋亡，腰椎间盘的凋亡与其退变联系紧密［10］。细胞凋亡使椎间盘的渗透压、pH值、氧分压等因子出现异常，引起椎间盘内代谢产物的淤积，进而发生椎间盘的退变［11］。本研究对髓核细胞TUNEL染色观察显示：对照组腰椎间盘髓核内细胞较多，平均凋亡阳性细胞率明显低于病例组，提示细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因。TRAIL基因受多种因素的调节，包括反转录因子、表观遗传学因素和单核苷酸多态性和功能不同的亚型［12］。TRAIL蛋白可以被检测为跨膜型蛋白和可溶性蛋白［13］。TRAIL通过与5个同源受体的复杂配体-受体系统的相互作用发挥其生物效应，在正常生理条件下可以以不同的亲和力结合配体［14］。TRAIL受体系统的第5个受体是骨保护素，最初发现通过与NF-κB配体受体激动剂相互作用作为破骨细胞生成调节［15］。TRAIL基因对细胞凋亡存在不同细胞传递不同信号的特点，主要涉及到死亡受体复合物DISC、凋亡蛋白及凋亡抑制蛋白［12］。TRAIL介导的细胞选择性的凋亡涉及转化/感染细胞，非肿瘤细胞基本不受影响，并因此成为科学研究的热点［16，17］。国外实验证明，在正常细胞/组织中可能有其他的作用，也能促进存活/增殖，干扰多种细胞类型的分化，甚至能激活肿瘤细胞中的促生存信号通路［18］。多种异常刺激可以增加髓核细胞中的炎性因子（如IL-1β和TNF-α）表达，从而引起髓核细胞合成代谢与分解活性的失衡，加速了椎间盘退变。同时也有研究证实，高水平的TNF-α可以激活内源性和外源性途径中的Caspase-3蛋白发挥凋亡作用，因此本研究选择TNF-α作为诱导髓核细胞凋亡的刺激性因子［19，20］。

本次研究结果发现，TRAIL阳性率与TUNEL凋亡细胞阳性率成正比且经TNF-α处理后细胞增殖明显降低，细胞凋亡显著升高，Western blot检测结果显示TNF-α处理组细胞的Caspase-3蛋白含量明显高于其他组。此外本次研究发现，TRAIL-siRNA转染+TNF-α处理组细胞的活性、凋亡率及Caspase-3蛋白水平与对照组无明显差异，提示siRNA沉默TRAIL表达可抑制TNF-α诱导的细胞凋亡，并可显著抑制TNF-α诱导的Caspase-3激活和表达。由此本次研究认为，TRAIL和Caspase-3蛋白通过参与髓核细胞的凋亡而引发腰椎间盘退变。TRAIL是一种凋亡分子，能与死亡受体特异性结合后选择性诱导细胞凋亡。Caspase-3蛋白具有剪切DNA蛋白片段的功能，是调控细胞凋亡的关键因子。Eerenbeemt等［16］研究发现，TRAIL可激活死亡受体而启动外源性凋亡途径诱导髓核细胞凋亡，与本次研究结果相一致，并认为抑制TRAIL基因的表达使ERK通路失活可成为临床治疗IDD的潜在治疗靶点。与先前研究相一致的是，caspase-3在内源性（线粒体）细胞凋亡中发挥重要作用，短期抑制cas⁃pase-3可用于治疗损伤诱导的椎间盘退行性病变。

综上所述，髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关，TRAIL沉默能显著提高TNF-α对细胞活性的抑制作用并可显著抑制TNF-α诱导的髓核细胞凋亡及Caspase-3的活化和表达。