内质网应激介导的细胞凋亡在牙周炎促血管钙化中的作用

宋欣 陈艳青 李静 潘克清

(1 青岛大学附属医院口腔内科，山东 青岛 266003；2 青岛大学口腔医学院； 3 厦门大学附属妇女儿童医院厦门市妇幼保健院口腔科)

血管钙化是软组织在慢性炎症刺激下发生的类似于骨化过程的病理表现，是心血管系统疾病的独立危险因素[1]。细胞凋亡可引发血管平滑肌细胞钙化，而且在血管钙化的进程中广泛存在[2-3]。最新研究发现，内质网应激(ERS)是介导细胞凋亡的信号通路之一，并参与了血管钙化的过程[4]。可溶性蛋白和膜蛋白主要在内质网中进行合成和加工，当内质网功能受到刺激时，未正确折叠的蛋白质会发生积聚，从而引发ERS。轻度的ERS可产生保护细胞、减缓细胞损伤的作用，但是ERS超负荷时，则会启动细胞凋亡程序[5]。牙周炎是一种以牙菌斑微生物为始动因子的牙周组织的慢性炎症，是心脑血管病、糖尿病、慢性肾病和呼吸功能减退等的危险因素之一[6]。研究发现，牙周炎对血管钙化具有一定的促进作用[7-8]。本研究旨在探讨ERS介导的细胞凋亡是否参与了牙周炎促血管钙化的过程，及其参与的具体机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组

雄性Wistar大鼠40只[许可证号：SCXK(鲁)20130001]，8周龄，体质量(180±20)g，由青岛大学附属医院动物实验中心提供。40只大鼠随机分为4组，牙周炎组(CP组)、血管钙化组(VDN组)、牙周炎+血管钙化组(CP+VDN组)、对照组(C组)，每组10只大鼠。

1.2 药品与试剂

维生素D3购自上海通用制药有限公司；尼古丁购自美国Sigma公司；兔抗大鼠半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗体、兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)多克隆抗体、兔抗大鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)多克隆抗体、兔抗大鼠c-Jun氨基端激酶(JNK)多克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗体购买自北京Bioss公司；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购买自于武汉Boster公司；BHI液体培养基购买自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 各组的处理

CP组大鼠仅在实验第1天于左、右上颌第二磨牙牙颈部的龈沟内结扎4-0丝线，然后每周1次于牙龈缘接种牙周混合致病菌菌悬液(参照孟芸等[8]报道的方法由BHI液体培养基配置而成)0.1 mL，至实验结束；VDN组大鼠仅在实验第1天9:00肌肉内注射维生素D33×105U/kg 1次，将尼古丁(25 mg/kg)溶于花生油(5 mL/kg)中分别于9:00和18:00各灌胃1次；CP+VDN组大鼠先按照CP组的方法进行处理后，再按照VDN组方法进行处理；C组大鼠牙颈部的龈沟内没有结扎丝线，仅每周1次于左、右上颌第二磨牙龈缘接种0.1 mL生理盐水，同时在实验第1天9:00肌肉注射与维生素D3等体积的生理盐水，并于9:00和18:00灌胃花生油各1次。所有大鼠均在相同环境下常规喂饲8周后，全麻处死，取出大鼠的主动脉血管，固定、石蜡包埋，常规制作石蜡切片。本研究经青岛大学动物研究委员会批准[编号：AHQU20140425]，所有动物的处理均符合伦理要求。

1.4 苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学染色观察

将每组的组织切片随机分为两部分，一部分进行HE染色：使用常规脱蜡方法将石蜡切片脱蜡，进行苏木精染色，用水漂洗后进行伊红染色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。另一部分经常规脱蜡水化，进行免疫组化染色：将相对应的阳性染色片作为阳性对照(Caspase-3为兔肝脏组织，GRP78为人结肠癌组织，CHOP为人脑组织，JNK为人结肠组织，Caspase-12为兔心脏组织)，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。滴加H2O2溶液，室温孵育10 min，PBS洗涤3 min，共3次。微波修复抗原，PBS洗涤；滴加BSA封闭液，37 ℃作用30 min；滴加Ⅰ抗(1∶50稀释)，37 ℃作用2 h后，PBS洗涤；加入Ⅱ抗，37 ℃作用30 min后，PBS洗涤；加入SABC，37 ℃作用30 min，PBS洗涤，以上步骤中的洗涤均为3次，每次5 min；加入DAB显色剂，通过光镜控制显色时间，苏木精染色1 min，梯度乙醇脱水，透明、封片，光镜下观察并拍片。以大鼠血管平滑肌细胞当中出现棕褐色或者棕黄色颗粒作为Caspase-3、GRP78、CHOP、JNK及Caspase-12表达阳性。使用Image Pro Plus 6.0软件处理免疫组化染色结果，每个切片随机选择3个视野，测定吸光度(A)值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠主动脉血管组织病理学观察

HE染色结果显示，C组大鼠的主动脉血管内膜、中膜及外膜各层清晰完好(图1A)；CP组大鼠主动脉血管内膜相对完整，中外弹性膜显示局部纤维层松散无序，出现破损(图1B)；VDN组大鼠主动脉血管壁厚度增加，血管组织中弹性纤维组织结构更加松散，平滑肌细胞增殖并呈无序排列(图1C)；CP+VDN组大鼠主动脉血管壁明显增厚，病变破坏可累及管壁全层，血管组织中弹性纤维排列疏松紊乱，主动脉平滑肌细胞坏死减少(图1D)。

A：C组，B：CP组，C：VDN组，D：CP+VDN组，HE染色，400倍图1 各组大鼠主动脉血管组织病理形态学观察

2.2 各组大鼠免疫组织化学染色结果

免疫组织化学染色结果显示，牙周炎和血管钙化两种因素对Caspase-3、GRP78及CHOP表达均具有显著影响，并且对CHOP具有交互作用(F=585.53～1 157.70，F交互=14.76，P<0.05)。与C组相比，其他组大鼠血管组织中Caspase-3和GRP78的表达水平显著升高(F=680.12、708.93，P<0.05)，CP+VDN组大鼠主动脉血管组织中Caspase-3和GRP78的表达高于其他组(P<0.05)。牙周炎和血管钙化对JNK及Caspase-12表达无明显影响(P>0.05)。对CHOP表达影响的单独效应分析结果显示，当血管钙化因素不存在时，牙周炎因素则会导致CHOP表达升高(F=200.20，P<0.05)；当血管钙化因素存在时，牙周炎因素会导致CHOP的表达进一步升高(F=407.30，P<0.05)；当牙周炎因素不存在时，血管钙化因素会使CHOP表达升高(F=276.69，P<0.05)；当牙周炎因素存在时，血管钙化因素会导致CHOP的表达进一步升高(F=436.96，P<0.05)。见图2、表1。

图2 各组大鼠血管组织中各蛋白的表达(Envision，400倍)

表1 各组大鼠中各项因子的表达

3 讨 论

牙周炎是牙周组织的慢性感染性疾病，与体内多种全身疾病的发生发展密切相关[9]。血管钙化是一种可由慢性炎症引起的异常钙质沉积，是血管病变中的常见表现[10]。流行病学研究显示，牙周炎和血管钙化间呈显著正相关[11-12]。本研究采用龈沟内丝线结扎合并牙龈接种牙周致病菌的方法建立大鼠牙周炎模型，HE染色结果显示，大鼠主动脉血管壁中外弹性膜局部纤维层疏松、断裂，提示牙周炎可能会引起血管壁结构损伤，对血管钙化具有一定的促进作用。

细胞凋亡机制复杂多样，涉及到一系列蛋白及蛋白酶的激活与调节。Caspase-3属于凋亡效应因子，参与下游特异性底物的裂解，是细胞凋亡过程中最关键的一种因子，一旦被激活，则细胞凋亡进程不可逆转[13]。LUO等[14]报道Caspase-3是参与心血管平滑肌细胞凋亡的主要执行者。当血管平滑肌细胞发生凋亡时，凋亡小体会促进钙盐沉积，继而启动血管钙化[15]。本研究免疫组织化学染色结果显示，Caspase-3在VDN组大鼠主动脉血管组织中的表达显著高于C组，提示在血管钙化过程中存在细胞凋亡情况；CP组大鼠主动脉血管组织中Caspase-3的表达比C组高，提示牙周炎可能会促使血管组织发生细胞凋亡；CP+VDN组大鼠主动脉血管组织中Caspase-3的表达最高，表明在牙周炎合并血管钙化时，血管组织中的细胞凋亡程度明显增加，提示细胞凋亡可能参与了牙周炎促血管钙化的过程。

近年研究发现，ERS是介导细胞凋亡的信号转导路径之一[16]，与心血管系统损伤的发生有关[17]。GRP78的上调是ERS被激发的重要标志[18]。发生慢性牙周炎时，牙周袋内的致病菌及其多种毒性因子可能通过受损的牙周组织进入血液循环中，引发炎症级联反应，影响主动脉壁血管内皮细胞和平滑肌细胞的功能。KOZAROV等[19]报道在动脉粥样硬化病变的组织中可检测到活的牙周致病菌，LIU等[20]研究显示牙龈卟啉单胞菌的毒性因子脂多糖可刺激血管平滑肌细胞，促进其成骨化及钙化。炎症刺激、钙稳态失衡及氧化应激可使内质网腔中蛋白质折叠异常，引起ERS，导致GRP78和GRP94表达上调，以减少蛋白质合成并促进其正确加工和降解。当ERS超负荷时，GRP78的表达量不足以稳定蛋白质折叠，细胞质网络动态平衡发生改变，导致细胞功能失调，并启动细胞凋亡，进而参与了血管钙化的发生和发展过程。本研究结果显示，GRP78在CP组、VDN组、CP+VDN组大鼠主动脉血管组织中的表达显著高于C组，可能存在ERS介导的细胞凋亡，其中，CP+VDN组大鼠主动脉血管组织中GRP78的表达水平最高，提示ERS介导的细胞凋亡可能是牙周炎促血管钙化过程中的机制之一。

ERS可以通过Caspase-12、JNK通路以及CHOP/GADD153基因转录三种途径介导细胞凋亡[21]。本研究结果显示，牙周炎和血管钙化两因素对CHOP的表达有协同升高的作用，这提示ERS介导的细胞凋亡可能是通过CHOP通路参与了牙周炎促血管钙化的进程。信号蛋白CHOP是ERS特有的转录因子，参与ERS并介导细胞凋亡。在非应激条件下，CHOP通常以较低的表达量存在于胞质中，但当ERS被激活时，CHOP的表达可通过内质网膜上的Ⅰ类跨膜蛋白IRE1、PERK及Ⅱ类跨膜蛋白ATF6三条信号通路显著增高，当ERS过反应时，BIM等促凋亡基因表达上调，Bcl-2等抗凋亡基因表达下调，从而介导细胞凋亡的发生[22]。本研究中血管组织中JNK与Caspase-12微量表达，分析其原因，可能是由于发生ERS时，一部分活化的跨膜蛋白IRE1可以促使肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)从与Caspase12前体结合的复合体中解离，并与其在内质网膜上结合，同时激活了Caspase-12[23]。而IRE1-TRAF2复合体通过活化凋亡信号调节激酶1(ASK1)，又引发了下游JNK的磷酸化，使此路径被激活[24]。但析因分析结果显示，牙周炎和血管钙化因素对JNK和Caspase-12的表达无显著影响，提示这两种通路在牙周炎促血管钙化的过程中可能并非主要途径。

总之，本研究通过对各组大鼠主动脉血管组织进行免疫组化检测，结果提示ERS介导的细胞凋亡可能参与了牙周炎促血管钙化的过程，其机制可能与CHOP通路有关。本研究为今后进一步揭示牙周炎促血管钙化的作用机制奠定了基础，为研究全身系统性疾病的临床防治提供了部分参考依据。