中心复合设计-效应面法优化复方延胡索微乳凝胶贴膏中挥发油的提取工艺

高俊玲王慧凯王滨王振伟李新新宫凯凯黄莹洁满玉清,李燕

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 滨州市中医院 山东 滨州 256600; 3 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603

复方延胡索微乳凝胶贴膏处方来源于临床验方，由延胡索、当归、桂枝、鸡血藤组成。在临床应用时将四味药打成细粉，热水调敷，现用现配，具有活血养血、行气、活络止痛等功效，常用于骨关节炎、关节疼痛等的治疗，疗效肯定，但因制作程序较繁琐，在一定程度上限制了该验方的应用范围，目前尚无相关制剂的研究，本课题旨在以该验方为基础，制作方便临床使用的新剂型，以扩大应用范围，并为骨关节炎症患者提供新的治疗药物。该方中当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv．) Diels的干燥块根，挥发油是当归的主要药效成分，其在当归中含量约占1%；当归挥发油又包括亚丁基苯酞、丁烯基酞内酯、藁本内酯、洋川芎内酯等[1]；桂枝为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的嫩枝，含挥发油类成分，具温阳通脉，助阳化气之功效，主要活性成分是挥发油，而挥发油中桂皮醛是主要的抗炎活性物质[2]，可减轻RA小鼠模型软骨的炎症与降解，降低淋巴细胞中氮自由基含量，抑制血清中核因子活化的T细胞C1(NFATc1)，TNF-α，碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)，钙依赖型蛋白酶的mRNA(m-Calpain)的表达[3]。综上所述，当归、桂枝挥发油均与抗炎、止痛的药理作用密切相关，因此需要对两种饮片单独提取挥发油。

效应面法(response surface methodology，RSM)是集数学和设计最佳组合等技术为一体的一种综合应用，与均匀、正交设计相比，精度更高，预测性更好，近年来被广泛用于工艺优化[4]。本文采用中心复合设计-效应面法以加水量、浸泡时间、提取时间作为考察因素，挥发油收率、蒿本内酯、桂皮醛含量作为优化指标优选提取工艺，旨在提高制剂提取水平，为制剂工艺与产品开发提供有效、可靠的实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1100液相色谱仪(Agilent Technologies1260 Infinity Ⅱ)；BS110S型精密电子天平(瑞士Mettler Toledo仪器有限公司)；数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)

1.2 试药 藁本内酯对照品(上海源叶生物科技有限公司，含量98%，批号：B20492)；桂皮醛对照品(上海源叶生物科技有限公司，含量98%，批号：B21481)；甲醇(色谱纯，天津盛世萨格科技有限公司)，色谱用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 溶液的配制

2.1.1.1 藁苯内酯对照品溶液的制备 精密称量藁苯内酯对照品6.01 mg于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，低温、避光保存备用。

2.1.1.2 桂皮醛对照品溶液的制备 精密称量桂皮醛对照品3.18 mg于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，低温、避光保存备用。

2.1.1.3 供试品溶液的制备 取按规定方法制得的混合挥发油适量，石油醚萃取，无水硫酸钠干燥，加甲醇超声溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，低温、避光保存备用。

2.1.1.4 阴性对照液的制备 按上面制备方法分别制备不含当归、桂枝、当归和桂枝的阴性溶液。

2.1.2 色谱条件[4]色谱柱为ThermosC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(55∶45)；流速为1 mL/min；检测波长为285 nm，进样量为20 μL；柱温为30℃。

2.1.3 线性关系考察 精密量取蒿本内酯和桂皮醛对照品溶液0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，各置50 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得系列浓度对照品溶液，各取对照品溶液20 μL，进样，测定峰面积。以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归，蒿本内酯在2.404～60.010 μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=3.720 4×104X+24.530(R2=0.999 9)；桂皮醛在1.272～31.800 μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=2.164 3×104X-41.739(R2=0.999 9)。

2.1.4 精密度试验 取不同浓度蒿本内酯、桂皮醛对照品溶液，在“2.1.2”项色谱条件下分别进样5次，分别测得峰面积的RSD为1. 22%、1.16%，表明方法精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取混合挥发油共5份，在“2.1.2”项色谱条件下进样分析，测定蒿本内酯含量的RSD 1. 09%，桂皮醛含量的RSD 1.20%，表明方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 取已知含量的混合挥发油1.0 g，精密称定，共6份，分别精密加入蒿本内酯对照品4.50 μg、桂皮醛2.40 μg，在“2.1.2”项色谱条件下进样分析，计算出平均加样回收率为99.1%，RSD 1.1%，表明方法准确度良好。见图1。

A 蒿本内酯对照品；B桂皮醛对照品；C 混合对照品；D样品；E 桂皮醛阴性；F 蒿本内酯阴性；G双阴性溶液。

2.2 提取方法优选 挥发油测定器(中国药典规格，安徽天长市康博实验设备有限公司)，DJ600-2型电子天平(成都倍塞克仪器表研究所)；电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)，药典筛(绍兴市上虞圣超仪器设备有限公司)。

当归饮片(产地甘肃岷县)、桂枝饮片(产地广西)，石油醚(天津市天力化学仪器有限公司)，二甲苯(天津市恒兴化学仪器有限公司)，饮片均购于河北省安国中药饮片有限责任公司，并经山东省滨州市中药鉴定专家王君教授鉴定，当归为伞形科植物当归的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂干燥嫩枝，均符合《中国药典》[5]2020年版一部相关项下规定，其他试剂均为分析纯。

2.2.1 吸水率的考察 将饮片粉碎至过20目筛，称取当归、桂枝两味中药饮片各100 g，放入同一烧杯中，加入水的体积记为A1，待浸润至全部透心，过滤出剩余的水A2，并计算吸水率(表1)。

表1 饮片吸水率的考察

2.2.2 挥发油提取方法 以《中国药典》2020 年版第四部挥发油测定法乙法(2204 通则)为指导测定挥发油含量，并计算挥发油收率。挥发油收率=挥发油体积/饮片质量×100%

2.3 单因素实验 以挥发油中蒿本内酯和桂皮醛在挥发油中各自所占质量分数、挥发油收率为CQAs，考察相关因素变化时CQAs相应的变化趋势。

2.3.1 粉碎粒度 称取当归、桂枝各100 g，补足吸水率1.67倍，浸泡2 h，提取8 h，考察粉碎粒度分别过10、24、50、65目筛时对CQAs的影响。挥发油收率随着粉碎粒度的增加先增大，到一定的粉碎粒度后呈下降趋势(图2)。

A 粉碎粒度对蒿本内酯、桂皮醛含量的影响；B 粉碎粒度对挥发油收率的影响。

2.3.2 加水量 称取当归、桂枝粗粉(过24目筛，下同)各100 g，补足吸水率1.67倍，浸泡2 h，提取8 h，考察加水量分别为5、6、7、8、9、10、11倍时，挥发油收率的变化。结果显示：加水量在5～10倍区间内蒿本内酯、桂皮醛含量、挥发油收率随着加水量的增加而增加，超过10倍以上变化不明显，见图3。因此，初步确定考察加水量在5～10倍区间内对CQAs的影响。

2.3.3 浸泡时间 称取当归、桂枝粗粉各100 g，补足吸水率1.67倍，加水量为8倍，提取8h，考察浸泡时间分别为0、30、60、90、120、150、180 min时CQAs的变化。结果表明：浸泡时间在0～120 min区间内，挥发油收率随着浸泡时间的延长而增加，超过120 min变化不明显，蒿本内酯、桂皮醛在挥发油中的含量比例变化较小，见图4，因此考察浸泡时间为60～120 min内对CQAs的影响。

A 浸泡时间对蒿本内酯、桂皮醛含量的影响；B 浸泡时间对挥发油收率的影响。

2.3.4 提取时间 称取当归、桂枝各100 g，补足吸水率1.67倍，8倍加水量，浸泡2 h，考察提取时间在0～11 h内挥发油收率的变化。结果显示：提取时间在0～10 h内，挥发油收率随提取时间的延长而明显增加，超过10 h，挥发油收率增加不明显，而蒿本内酯、桂皮醛在挥发油中的含量在达到一定的提取时间后呈下降趋势，提示相关成分在长时间的加热后可能导致分解或异构化(图5)。因此，考察提取时间在0～10 h内对挥发油收率的影响。

A 提取时间对蒿本内酯、桂皮醛含量的影响；B 提取时间对挥发油收率的影响。

预实验及单因素试验结果显示，药粉过粗，浸泡时间过长，有效成分溶出度较少，时间成本相对增加；然而药粉过细，也会出现新的问题，如有效成分溶出度减少，或者油细胞被破坏而导致最终出油率降低，在合理范围内，CQAs变化不明显，结合文献及预实验结果，最终选取通过24目筛为最终粉碎粒度。浸泡时间、加水量、提取时间对影响挥发油收率影响较大，因此确定以上三个因素作为CPPs，并确定各自的合理区间。

2.4 中心复合设计-效应面法 根据 Central Composite 中心复合设计的原理，参考单因素试验结果，以加水量(A)、提取时间(B)和浸泡时间(C)三个对挥发油收率影响较大的因素为自变量，以蒿本内酯(Y1)、桂皮醛含量(Y2)以及挥发油得率(Y3)为优化指标，进行3因素5水平的响应面试验，用代码-α、-1、0、1、α(α=1.732)表示，当归、桂枝挥发油水蒸气蒸馏提取工艺因素水平(表2)，当归、桂枝挥发油提取工艺中心组合设计及结果(表3)。

表2 当归、桂枝挥发油水蒸气蒸馏提取工艺因素水平

表3 当归、桂枝挥发油提取工艺中心组合设计及结果

2.5 模型拟合与方差分析 运用 Design-Expert 8.0.6版软件将实验结果进行统计处理，以蒿本内酯含量(Y1)、桂皮醛含量(Y2)、挥发油收率(Y3)对考察因素(A、B、C)进行多元线性回归和二项式拟合，经F检验，采用 ANOVA 分析效应面的回归参数，方差分析结果见表4，从表中可以看出，影响挥发油中蒿本内酯和桂皮醛含量的主要因素为提取时间，但在加热至一定时间后后二者含量均会降低，可能由于二者均热不稳定[6-7]有关，加水量与提取时间对挥发油收率的影响显著，浸泡时间为其不显著因素，三者均为模型显著(P<0.001)，失拟项不显著(P>0.05)，说明所得方程与实际情况拟合度良好，有较大可信度，预测性较好，可以利用该模型分析预测最佳工艺条件。

表4 回归方程显著性检验

拟合方程如下：

Y1=38.83+0.134A+7.17×10-2B+1.356C-1.25×10-2AB-5×10-3AC-8.25×10-2BC-3.825×10-2A2-1.159×10-2B2-1.733C2；

Y2=23.53+5.312×10-2A+3.589×10-2B+1.99C-7.5×10-3AB-4.25×10-2AC-3.75×10-2BC-3.296×10-1A2-2.546×10-1B2-1.785C2;

Y3=0.4092+2.754×10-2A+5.261×10-3B+3.425×10-2C+1.875×10-3AB-1.437×10-2AC-5.625×10-3BC-1.802×10-2A2-5.516×10-3B2-8.849×10-3C2。

若以P<0.05为有显著性差异，则三个模型均具显著性差异，根据各模型分析结果来看，A、C对Y1具有显著性影响；C、A2、B2、C2对Y2具有显著性影响；A、C、AC、A2、C2对Y3具有显著性影响。利用 Design-Expert8.0.6软件的Analysis模块绘制因素间交互作用有显著性差异的因素对考察指标：即A、C对Y1；A、C对Y3的三维效应面图和等高线图，见图6。

图6 加水量(A)和提取时间(C)对挥发油得率(Y3)的曲面图和等高线

2.6 工艺优化与预测 综合考虑各影响因素及图1最优区域，将各考察因素A、B、C及优化指标Y1、Y2、Y3上限设为尽可能大，根据软件的Optimization 模块叠加各模型所得的最佳条件范围得到最终的最优处方：加水量：9.75倍，浸泡时间为95.23 min，提取时间：7.91 h，预测在此条件下制得的挥发油含蒿本内酯39.20%、含桂皮醛23.30%，挥发油收率为0.413%，为方便工业生产，可将各最优条件调整为加水量10倍，浸泡时间100 min，提取时间8 h。

称取当归、桂枝各100 g混匀，共三份，以最优条件提取挥发油，分别测定蒿本内酯、桂皮醛含量、挥发油得率，结果如表5所示，三次试验的实际值与预测值误差均小于0.05，预测性好，RSD值较小，工艺重现性好。

表5 当归、桂枝最优提取工艺验证性试验

中心复合设计-效应面法应用于优选复方延胡索微乳凝胶贴膏挥发油提取工艺准确性高，可较好地描述加水量、浸泡时间、提取时间三因素对蒿本内酯、桂皮醛含量及挥发油收率之间的函数关系，所建模型得到的工艺参数合理可靠。

3 讨论

钟立甲[8]等运用代谢组学技术研究得出当归挥发油对炎症过程机体代谢紊乱发挥正向调节作用。徐锋[9]等通过查阅文献总结得出，桂枝挥发油的抗炎作用较好，其分子机制与干预Toll样受体4(TLR4)表达、抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路有关；桂枝挥发油还可抑制Toll样受体2(TLR2)的表达及蛋白酪氨酸激酶(PTK)、前列腺素E2的活性，其中桂皮醛可抑制环氧酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的表达。挥发油的含量多少对最终制剂的药效有较大影响，因此选用先进、预测准确的软件优选当归、枝混合混发油的提取工艺尤为重要。

预实验时对饮片粉碎粒度进行考察，发现药粉过粗，浸泡时间过长，有效成分溶出度较少，时间成本相对增加；然而药粉过细，也会出现新的问题，如有效成分溶出度减少，或者油细胞被破坏而导致最终出油率降低，结合文献及预实验结果，最终选取通过20目筛为最终粉碎粒度。

本实验当归、桂枝混合提取的挥发油中同时存在重油、轻油，预实验时分别考察过采取轻油装置加二甲苯、轻油装置不加二甲苯、重油装置加二甲苯、重油装置不加二甲苯四种装置提取挥发油，结果均不利于挥发油的体积读取和收集，为减小测量误差，准确记录挥发油体积，最后确定参照《中国药典》2020年版第四部挥发油测定法乙法(2204通则)进行试验，读数前处理如下：将收集的挥发油使用石油醚(30-60)萃取，无水硫酸钠脱水干燥，用移液管吸取挥发油进行测量、计数，为优选最佳提取工艺做基础。