中老年2型糖尿病牙周炎患者龈沟液抗菌肽水平及其与牙周临床指标的相关性

张雅萌， 张惠媛， 阮世红， 陈晓春， 甘雪琦， 于海洋

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床研究中心 四川大学华西口腔医院，四川 成都（610041）；2.深圳市慢性病防治中心，广东 深圳（518000）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一种几乎存在于所有多细胞生物体内的小分子活性多肽。抗菌肽是先天免疫反应的重要组成部分，具有直接的抗菌活性和免疫调节作用［1］。在人类唾液和龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）中发现的抗菌肽主要包括组织蛋白酶抑制素和防御素，抗菌肽LL-37是迄今发现唯一人源性的组织蛋白酶抑制素家族成员［2］。人体内的防御素根据分子结构不同又可分为α防御素和β防御素。牙周炎是一种发生在牙周组织的破坏性炎症疾病［3］。有研究表明抗菌肽人β 防御素-2（human beta defensins-2，HBD-2）基因组拷贝数低会增加患严重慢性牙周炎的风险［4］，唾液和龈沟液抗菌肽LL-37 水平与深袋牙和临床附着丧失呈正相关［5］。抗菌肽HBD-2 和抗菌肽LL-37与牙周炎之间存在着密切联系。

与牙周炎相关的一些全身危险因素（如吸烟、糖尿病、肥胖等）也会引起抗菌肽的表达失调［6］。糖尿病是一种以血糖水平升高，糖耐量降低为主要症状的代谢性疾病，其中具有胰岛素抵抗的2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病机制与慢性炎症反应密切相关，是牙周炎的重要危险因素之一［3］。体外实验显示高糖环境下角质形成细胞分泌HBD-2 显著减少［7］。Arampatzioglou 等［8］发现糖尿病患者抗菌肽LL-37 表达降低与创面难以愈合和继发感染相关。但是关于2 型糖尿病人群龈沟液中抗菌肽的变化规律研究尚不充分。本试验研究牙周炎合并T2DM 患者龈沟液中抗菌肽LL-37、HBD-2 水平的变化及其与牙周临床指标的相关性，旨在探讨龈沟液中抗菌肽与T2DM和牙周炎之间的关系及其互相影响机制，为阐明糖尿病患者牙周破坏的致病机理、早期诊断提供基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

弗罗里达探针（Florida Probe，美国）；滤纸条（Whatman，英国）；酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒Human BD-2/beta Defensin-2 ELISA Kit（Arigobio，中国），Human LL-37 ELISA Kit（HycultBiotech，荷兰）；Multiskan FC 型酶标仪（Thermo，美国）。

1.2 研究对象

本研究选择2019 年11 月至2020 年6 月到深圳市慢性病防治中心口腔科和内科就诊的患者77人，平均年龄为（60.35 ± 8.87）岁。该研究获得了深圳市慢性病防治中心伦理委员会批准（批准号：20181202），所有志愿者均在取样和收集信息前签署了书面知情同意书。

纳入标准：年龄45～85 岁；受试者口内至少有20 颗牙齿。排除标准：患有T2DM 之外的任何全身性疾病；3 个月内使用过抗生素的患者；6 个月内接受牙周治疗的患者。

分组标准：根据1999 年世界卫生组织提出的糖尿病诊断标准进行T2DM 诊断，按照美国牙周学会和欧洲牙周联盟提出的2018 年牙周病和植体周病国际新分类［9］进行牙周炎诊断。根据参与者的全身和牙周健康状况分为4 个研究组：全身健康并牙周健康对照组（健康对照组）22 人、全身健康牙周炎组19 人、T2DM 牙周健康组15 人、T2DM 合并牙周炎组21 人。

1.3 方法

1.3.1 牙周临床指标收集 采用弗罗里达探针对每颗牙齿的颊（唇）、舌侧分别在近中、中央、远中6个位点进行探诊检查（除了第三磨牙和被牙龈覆盖的残根）。检查内容包括探诊深度（probing depth，PD）、临床附着力丧失（attachment level，CAL）；根据探测30 s 内是否存在出血将探诊出血（probing bleeding，BOP）分为阳性和阴性，记录并计算探诊出血阳性位点所占百分比（BOP%）。每位患者的PD、BOP%值为上述各部位的平均值，CAL 值为上述各部位的最大值。牙周检查均由一位已进行培训的口腔科医生完成，并做标准一致性检验，Kappa ＞0.75。

1.3.2 龈沟液的收集 牙科三用枪清洁牙面上的软垢后，棉卷隔湿患者的待检测牙位，在四颗第一磨牙的近中、远中及颊侧龈沟或牙周袋内分别插入3 条2 mm×10 mm 滤纸条，并放置30 s。若第一磨牙缺失，则检测该区第二磨牙。将同一受试者的12 条滤纸条一并放入1.5 mL 离心管中，并加入500 μL 的PBS 液并保存在-80 ℃冰箱中备用。

1.3.3 抗菌肽的检测 保存待测的龈沟液样本与试剂盒常温放置30 min，加入缓释液离心后，保留上清液，使用ELISA 试剂盒Human BD-2/beta Defensin-2 ELISA Kit 和Human LL-37 ELISA Kit 检测龈沟液中HBD-2 和LL-37 浓度。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23 进行统计学分析。Shapiro-Wilk检验显示数据均不服从正态分布，数据用中位数（第一四分位数，第三四分位数）表示，多组间比较使用Kruskal-WallisH检验，两组间比较使用Mann-WhitneyU检验；Spearman 相关检验分析抗菌肽与临床牙周参数之间的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 全身健康组与T2DM 组牙周临床指标比较

如表1 所示：T2DM 牙周健康组与健康对照组的PD、CAL、BOP 牙周临床指标值差异不明显（P＞0.05）；T2DM 合并牙周炎组的PD 值大于全身健康牙周炎组（P＜0.05）。

表1 全身健康组与T2DM 组牙周临床指标比较Table 1 Comparison of the periodontal clinical indexes between the healthy group and T2DM group Median（IQR）

2.2 各组龈沟液中抗菌肽水平比较

比较各组龈沟液中抗菌肽HBD-2 和LL-37 的水平，如表2 所示，全身健康牙周炎组HBD-2 和LL-37 水平均高于健康对照组（P＜0.05）；T2DM 牙周健康组HBD-2 水平低于健康对照组（P＜0.05）；T2DM 牙周健康组HBD-2 和LL-37 水平低于全身健康牙周炎组（P＜0.05）；T2DM 合并牙周炎组HBD-2水平低于全身健康牙周炎组（P＜0.05）；其余组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组龈沟液中抗菌肽水平Table 2 Antimicrobial peptide levels in gingival crevicular fluid of each group Median（IQR）

2.3 牙周炎龈沟液中抗菌肽水平与牙周临床指标的相关性

对全身健康牙周炎组和T2DM 合并牙周炎组的龈沟液中抗菌肽水平与牙周临床指标进行Spearman 相关性分析。如表3 所示，全身健康牙周炎组中HBD-2 与PD 呈正相关（P＜0.05），HBD-2 与CAL 呈正相关（P＜0.05），HBD-2 与BOP%的相关性无统计学意义（P＞0.05）；LL-37 与PD、CAL 呈正相关（P＜0.05），LL-37 与BOP%的相关性无统计学意义（P＞0.05）。如表4 所示，T2DM 合并牙周炎组龈沟液中抗菌肽HBD-2、LL-37 与牙周临床指标相关性无统计学意义（P＞0.05）。

表3 全身健康牙周炎组龈沟液中抗菌肽水平与牙周临床指标的相关性Table 3 Correlation between the antimicrobial peptide levels in the gingival crevicular fluid and the periodontal clinical indicators in systemically healthy controls in the periodontitis group

表4 中老年T2DM 合并牙周炎组龈沟液中抗菌肽水平与牙周临床指标的相关性Table 4 Correlation between the antimicrobial peptide levels in gingival crevicular fluid and the periodontal clinical indicators in elderly patients with T2DM periodontitis

3 讨 论

3.1 全身健康人群龈沟液中抗菌肽水平

牙周组织抵御微生物侵犯的第一道防线包括了牙龈上皮的物理屏障作用和其分泌的抗菌物质（如抗菌肽、溶酶体酶等）所形成的化学屏障［10］。龈沟液为牙龈上皮渗出液，内含牙龈上皮分泌的抗菌物质［11］。本研究发现，与健康对照组相比，全身健康牙周炎组龈沟液中的抗菌肽（包括HBD-2和LL-37）水平升高。Sidharthan 和Öztürk 等［12-13］发现牙周炎患者龈沟液中HBD-2 水平明显高于牙龈炎患者和牙周健康人群，Soldati 等［14］发现牙周炎龈沟液中LL-37 的水平明显上升，吸烟会导致龈沟液中LL-37 降低。但Yilmaz 等［15］发现牙周炎时唾液中仅LL-37 升高而HBD-2 与牙周健康对照组无差异，这种不一致可能因为其采集的样本为唾液而非龈沟液，HBD-2 由上皮细胞分泌较多，龈沟液局部环境表达浓度较高，但唾液的稀释作用导致了差异减小，或因为在受炎症影响的牙周组织中，蛋白水解酶活性显著升高，其对HBD-2 的降解限制了组织中的HBD-2 向唾液的分泌。当牙周致病菌入侵，脂多糖等毒素直接刺激上皮细胞分泌抗菌肽，同时活化单核巨噬细胞分泌白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），IL-1β 升高可以刺激活化中性粒细胞，中性粒细胞也可以分泌抗菌肽。HBD-2、LL-37 均为诱导性表达的抗菌肽，LL-37 主要由中性粒细胞表达，HBD-2 更多由上皮细胞分泌［5］。带正电荷的抗菌肽除了静电吸引直接杀菌作用外，还是重要的免疫调剂。抗菌肽作为趋化因子同时诱导其他趋化因子的产生，可抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子的产生，调节树突状细胞或T 细胞，是先天免疫与获得性免疫的桥梁。Yang 等［16］发现LL- 37 促进角质细胞自噬作用，可减少胞内牙周致病菌。还有研究表明，抗菌肽相关基因的改变也可能与牙周炎症有关，如抗菌肽HBD-2 基因组低拷贝会增加严重慢性牙周炎的风险［4］。不同牙周状态下抗菌肽的变化也提示了抗菌肽作为牙周炎生物标志物的可能性。

3.2 中老年T2DM 患者龈沟液中抗菌肽水平

本研究结果显示中老年T2DM 合并牙周炎组的HBD-2 显著低于全身健康的牙周炎组，LL-37 虽呈降低趋势但无明显统计学差异。有体外研究显示，高葡萄糖浓度下角质细胞功能受损，HBD-2 的表达明显下调［17］，免疫细胞分泌LL-37 显著减少［18］。牙周炎时T2DM 患者唾液中HBD-1，2，3 明显低于全身健康人群［15］。目前关于T2DM 患者龈沟液内LL-37 水平的信息有限。人源阳离子抗菌肽-18（human cationic antimicrobial peptide-18，hCAP-18）是LL-37 的前体，可通过外界刺激脱去保守片段成为LL-37 活性片段。研究发现糖尿病患者牙龈组织中hCAP18 的表达水平上调［19］，另有研究表明糖尿病会引起中性粒细胞功能障碍［8］，如趋化功能受损，这可能是导致T2DM 患者牙周组织中hCAP18 上调但龈沟液中LL-37 活性片段分泌并没有增加的原因。抗菌肽在牙周炎患者龈沟液中会发生降解，特别是在存在牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）的位点，而T2DM 人群的口腔P.g检出率明显高于无系统性疾病的人群［20］。P.g对抗菌肽的降解作用也可能是T2DM 患者龈沟液中抗菌肽下调的原因之一。

3.3 龈沟液中抗菌肽水平与牙周临床指标相关性

牙周临床指标PD 值和CAL 值能直接反映牙周炎的破坏程度，本研究显示全身健康牙周炎组HBD-2 、LL-37 与CAL 显著正相关，这与Ramamoorthy 等［21］研究结果相似，提示炎症刺激了抗菌肽上调进而发挥其抗菌、免疫调节等作用。体外试验显示β 防御素还可以促进人类间充质干细胞、成骨细胞和角质形成细胞的增殖［22］。Peng 等［23］发现β防御素可促进骨再生和防止感染。有研究表明抗菌肽LL-37 可增加牙龈成纤维细胞产生基质金属蛋白酶-1 的组织抑制剂，可调节成纤维细胞在牙周组织重建的反应［24］。Yu 等［25］发现LL-37 可通过P2X7 受体和MAPK 信号通路减弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对成骨的抑制作用。以上体外试验均从机制层面解释了HBD-2 和LL-37 的牙周保护作用。此外，人工合成抗菌肽可用于治疗糖尿病足、牙周炎感染［26］。有研究发现激光照射诱导LL-37 和HBD-2 的表达，可促进组织愈合和清除P.g［27］，这也提示了HBD-2 和LL-37 在牙周组织中，尤其是细菌入侵、炎症反应时产生的保护作用。与全身健康牙周炎组不同，T2DM 合并牙周炎组HBD-2 和LL-37 与牙周临床指标的相关性没有统计学意义，这可能是因为糖尿病对抗菌肽的抑制作用使得牙周炎症反应时抗菌肽无法升高至正常浓度发挥其牙周保护功能，导致了T2DM 患者牙周破坏的进一步加重。

综上，全身健康人群患牙周炎时，抗菌肽参与到免疫调节中，对牙周病原微生物有明显的抑制和消灭作用，牙周破坏加重时，抗菌肽会进一步升高起到牙周保护作用。中老年T2DM 患者龈沟液中抗菌肽HBD-2 的减少可能是牙周感染加重的原因之一。抗菌肽LL-37 与中老年T2DM 患者牙周健康的关系还需更大样本量的临床试验进一步验证。

【Author contributions】Zhang YM performed the experiments and wrote the article. Gan XQ and Yu HY revised the article. Zhang HY，Ruan SH and Chen XC designed the study. All authors contributed to the article and approved the submitted version.