钛表面微弧氧化-微波水热法铜铌涂层的制备及抗菌性研究

王天琦， 杜青， 谢伟丽

1.哈尔滨医科大学口腔医学院修复科，黑龙江 哈尔滨（150001）； 2.哈尔滨工业大学材料科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨（150001）

钛及钛合金由于优异的机械性能、高耐腐蚀性及良好的生物相容性等，被广泛应用于骨科手术及牙科种植体［1］。植入物表面改性是减少植入物相关感染发生的有效途径，同时也是可以在不破坏材料本身性能的情况下改性植入物界面属性相对简单的方法［2］。微弧氧化技术虽然可以通过调控电解液成分引入到涂层中一些生物活性元素，但部分生物活性元素以非晶形式存在于涂层内不具备好的生物活性，微波水热处理能更好地赋予涂层生物活性及活化表面性能［3］。铜离子在一定浓度下具有抗菌性能和生物活性，且不会对细菌产生耐药性［4］。铌具有较高的化学稳定性和生物相容性，含有铌元素的磷酸钙复合涂层可显著增加成骨细胞的碱性磷酸酶活性，具有促进成骨细胞钙化的作用［5］，但目前对于含铌涂层抗菌性能相关文献较少。本实验拟采用微弧氧化法在纯钛表面制备含钙磷元素陶瓷涂层，通过微波水热法合成含铜铌的涂层，观察分析涂层的结构表征，并测定其抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料及菌株

纯钛TA2（江浙钛制品有限公司，中国）；大肠杆 菌（Escherichia coli，E. coli）国 际 标 准 菌 株（ATCC25922）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）国际标准菌株（ATCC29213）均由哈尔滨兽医研究所提供。

1.2 实验试剂及主要仪器设备

LB 培养基（luria-bertni culture，LB culture）（百思生物技术有限公司，中国）；氯化铜（天津福晨化学试剂公司，中国）；草酸铌（上海麦克林生化科技有限公司，中国）；微弧氧化设备（MAO60-Ⅱ，西安理工大学，中国）；微波水热平行合成仪（XH-800S；北京祥鹄科技发展有限公司，中国）；扫描电子显微 镜（scanning electron microscope，SEM）（Helios Nanolab 600i，FEI，美国）；X 射线能谱仪（energy dispersive spectrometer，EDS）（Helios Nanolab 600i，EDAX，美国）；常温/高温多功能X 射线衍射仪（Xray diffraction，XRD）（X’PERT，Panalytical，荷兰）；生化培养箱（KB115，Binder，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1 试件的制备及分组 将纯钛TA2 用线切割加工成标准试件10 mm×10 mm×1 mm，表面预处理，依次用240#、400#、800#、1 000#的SiC 砂纸打磨去除其表面氧化层。将试件浸没在丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗30 min，吹干备用。

①MAO 组：预处理后的钛试件为阳极，不锈钢为阴极，置于带有搅拌系统的电解液中，将MAO60-Ⅱ型脉冲电源升至预设电压，制备MAO 涂层。电解液成分如表1 所示。工艺参数见表2。

表1 微弧氧化电解液成分Table 1 Composition of the microarc oxidation electrolyte

表2 微弧氧化工艺参数Table 2 Process parameters of the microarc oxidation

②MH-Cu 组：将带有MAO 涂层的钛片用夹具将其固定在微波水热反应釜中，样品完全浸没在40 mL 不同浓度的CuCl2溶液中，放入XH-800S 型微波水热平行合成仪中。微波水热处理引入Cu2+工艺参数及分组如表3。反应完成后，待样品自然冷却至室温后取出。去离子水冲洗，烘干备用。

表3 不同浓度CuCl2溶液微波水热处理的分组及工艺参数Table 3 Grouping and process parameters of microwave hydrothermal treatment of CuCl2 solutions with different concentrations

③MH-Nb 组：纯钛试件微弧氧化处理后，以0.1 mol/L 的草酸铌为反应液微波水热法制备含铌涂层，处理方法同MH-Cu 组。

④MH-Cu/Nb 组：根据扫描电子显微镜和能谱仪选择MH-Cu 组中引入铜最多的组别与0.1 mol/L的草酸铌溶液混合微波水热制备铜铌涂层，处理方法同MH-Cu 组。

1.3.2 涂层表面形貌、元素分析、物相组成 SEM下对涂层微观结构进行观察；EDS 测定涂层表面元素种类、含量及其元素面分布；XRD 对表面物相组成进行分析。

1.3.3 贴膜法测定抗菌性能 LB 培养基分别接种冻干株E. coli和S. aureus，37 ℃恒温培养24 h 后，再将其传至两代，接种环取菌株在LB 液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h，最后用麦氏比浊法将菌悬液浓度稀释至1 × 106CFU/mL。贴膜法测定本实验中MAO 组、MH-Cu 组中Cu2+引入量最多组、MHNb 组、MH-Cu/Nb 组表面涂层，将20 μL 菌悬液滴在24 孔板上的样品表面，用无菌性的PE 薄膜（0.855 cm × 0.85 cm）覆盖，在菌液均匀分布、不溢出状态下37 ℃培养24 h。将试样取出后置于20 mL 的PBS 中洗脱5 min。将100 μL 洗脱液滴在LB固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h 后菌落平板计数。抗菌率＝［（对照组平均回收菌落数-实验组平均回收菌落数）/对照组平均回收菌落数］×100%。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件对实验数据进行统计，数据符合正态性和方差齐性，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 表面元素含量、分布分析

EDS 显示，MHL-Cu、MHM-Cu、MHH-Cu 组表面均引入了Cu 元素，各组Cu 元素原子比例依次为（0.68 ± 0.04）%、（1.17 ± 0.06）%、（1.64 ± 0.03）%，差异有统计学意义（P＜0.01），因而选择MHH-Cu组与草酸铌混合经微波水热制备复合涂层（MHCu/Nb 组）。图1 为MHH-Cu 组涂层表面元素扫描图，可以看出各元素分布均匀，Ti 元素分布较为广泛，在微孔处含量较多；O、Si、P、Ca、Cu 元素主要分布在微孔周围，在孔内含量较少。图2、图3 分别为MH-Nb、MH-Cu/Nb 组表面元素分布图，与引入Cu 元素类似，各元素分布均匀，Ti 含量较多，分布在微孔处，其他元素主要分布在孔洞周围。

2.2 涂层表面形貌分析

图4a 为MAO 组的SEM 图，呈现典型的“火山口状”形貌，孔洞分布均匀，孔隙率为8.83%，通过右上角高倍扫描图可以观察到涂层表面较为光滑。MH-Cu 组表面形貌如图4b～4d 所示，涂层表面仍保持着多孔结构，随着Cu2+浓度的增加，孔洞尺寸变化不大，孔隙率略有下降（依次为8.13%、7.39%、6.92%），粗糙度增加，颗粒物粒径变大。MH-Nb 组涂层表面仍保持着火山状微孔（图4e），孔隙率（9.26%）较MAO 涂层有所增加，表面出现沟壑状，颗粒物较小，局部存在大颗粒沉积。MH-Cu/Nb 组涂层表面微孔尺寸变化不大（图4f），但孔隙率达到11.2%，涂层表面沟壑状明显，沉积物较多。

Figure 1 Distribution of elements on the surface of a microwave hydrothermal coating with a high copper content(× 5 000)图1 高铜组微波水热涂层表面元素分布（×5 000）

Figure 2 Distribution of the elements on the surface of the microwave hydrothermal coating containing niobium(× 5 000)图2 含铌组微波水热涂层表面元素分布（×5 000）

2.3 表面物相分析

MAO 组主要是Ti 和锐钛矿（Anatase）TiO2的衍射峰，含有少量的金红石（Rutile）相，TiO2的存在与能谱中元素含量相吻合（图5）。实验组可同时观测 到Anatase 和Rutile 相TiO2的 衍 射 峰，Rutile 相TiO2的衍射峰较MAO 组有所增强。各组的Anatase和Rutile 相TiO2的衍射峰强度基本相同。

2.4 贴膜法抗菌性能分析

Figure 3 Distribution of elements on the surface of the microwave hydrothermal coating of the copper-niobium composite group(× 5 000)图3 铜铌复合组微波水热涂层表面元素分布（×5 000）

Figure 4 Surface scanning electron microscope morphology of the coatings on each group of specimens图4 各组试件涂层的表面扫描电子显微镜形貌

Figure 5 X-ray diffraction patters of the different groups图5 各组X 射线衍射仪图谱

贴膜法测定各组试件表面培养24 h 对E. coli和S.aureus生长情况的影响（图6），菌落计数见表4。E. coli和S. aureus的菌落数分别为MAO 组：（590.3± 23.0）CFU、（488.0 ± 21.0）CFU，MHH-Cu 组：（46.0± 5.7）CFU、（34.7 ± 3.5）CFU，MH-Nb 组：（273.0 ±9.2）CFU、（213.0 ± 7.0）CFU，MH-Cu/Nb 组：（39.0 ±2.6）CFU、（28.3 ± 2.1）CFU，与MAO 组相比，MHHCu、MH-Nb、MH-Cu/Nb组E.coli和S.aureus菌落数均有不同程度减少，差异具有统计学（P＜0.001）；MHHCu、MH-Cu/Nb 组E. coli和S. aureus菌落 数均少 于MH-Nb 组，差异具有统计学意义（P＜0.001）；MHH-Cu 组E. coli和S. aureus菌落数与MH-Cu/Nb 组相比，差异无统计学意义（P＝0.521，P＝0.510），但两者对E.coli和S.aureus的抗菌率均达到92%以上。

Figure 6 Escherichia coli and Staphylococcus aureus after 24 h surface culture of each group of specimens图6 各组试件表面培养24 h 后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的情况

表4 各组试件对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果Table 4 Antibacterial effect of each group on Escherichia coli and Staphylococcus aureus n=3,±s

表4 各组试件对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果Table 4 Antibacterial effect of each group on Escherichia coli and Staphylococcus aureus n=3,±s

1): compared with MAO group, P ＜0.001; 2): compapred with MHH-Cu group,P ＜0.001;3):compared with MH-Nb group,P ＜0.001

Groups MAO MHH-Cu MH-Nb MH-Cu/Nb Antibacterial rate（%）-92.2 53.8 94.4 Antibacterial rate（%）-92.9 56.4 94.2 FP Escherichia coli Colony count（CFU）590.3±23.0 46.0±5.71）273.0±9.21）2）39.0±2.61）3）1 237.560＜0.001 Staphylococcus aureus Colony count（CFU）488.0±21.0 34.7±3.51）213.0±7.01）2）28.3±2.11）3）1 102.054＜0.001

3 讨 论

影响植入物周围软硬组织的种植体周围炎是牙种植最常见的并发症之一［6］，在种植体表面粘附的细菌被认为是生物膜形成的初始和关键步骤，这会导致种植体的失败。因此，对生物材料表面改性获得抗菌材料涂层以抑制病原微生物的粘附是目前研究的重点［7］。Scarano 等［8］认为细菌一旦早期定植，可能构成一个细菌库，随后可能污染种植体的周围环境，并干扰种植体周围软硬组织的健康，进一步影响骨整合。

微弧氧化是以轻金属为阳极，不锈钢板为阴极，首先在基体表面形成阳极氧化绝缘层，随着电压升高，绝缘层被击穿，金属基体在弧光放电产生的高温高压的作用下发生氧化，形成多孔纳米结构的陶瓷涂层［9］。本实验中，微弧氧化后形成了多孔的表面涂层，这种多孔结构可以促进周围新的骨组织向内生长和血管的生成，且结合牢固［10］。微波水热是在高温、高压、微波的共同作用下，提高反应物的活性，能快速有效将生物活性元素引入涂层中，同时保留生物活性元素的优势［11］。SEM 结果显示，同MAO 组相较，微波水热处理的涂层表面仍保持了微弧氧化独特的多孔结构，同时MH-Cu 组随着铜离子浓度增加，涂层表面孔隙率减小，粗糙度增加，颗粒物粒径稍有增加，MH-Nb、MH-Cu/Nb 组涂层孔隙率与MAO 组相比略有增加，这可能是草酸铌微波水热过程中释放气体引起的，颗粒物粒径较小，局部有沉积物。

羟基磷灰石主要由磷酸钙组成，是骨组织的主要成分，磷酸钙的形成在种植体与周围的骨组织之间产生了强烈的化学键，可以改善骨组织和种植体材料的同化［12］。本研究发现，经过微波水热方法，成功地在MAO 涂层表面引入了相应的抗菌元素。同时，钙、磷等元素仍保持在涂层表面，说明微波水热过程不会破坏涂层诱导HA 的能力。经过不同溶液微波水热处理后的涂层，各组涂层均以Anatase 和Rutile 相TiO2矿物成分组成，没有检测到含Cu 或者Nb 的相，可能是由于Cu、Nb 含量较少或以非晶形式掺杂在MAO 层表面。而Anatase 和Rutile TiO2能够诱导HA 形成，促进成骨细胞增殖分化［13］。涂层表面粗糙多孔结构及钙磷等活性元素对于成骨方面作用已有大量研究，本实验主要研究如何提高该涂层的抗菌性能。

Cu 作为人体必需的微量元素，有研究表明将Cu 离子作为抗菌离子引入钛及钛合金中时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有着明显的抑菌效果［14］。而含Nb 的涂层会增加种植体抗腐蚀性及生物相容性［15］。Wojcieszak 等［16］利用高能磁控溅射制备含有Cu 和Nb 的二氧化钛的涂层，与未掺杂的TiO2涂层相比，TiO2（Nb，Cu）的粗糙度较高，同时具有很好的抗菌性能。同样本实验中抗菌结果显示，与MAO 组相比，MHH-Cu、MH-Nb、MH-Cu/Nb 组均具有抑菌效果，而MHH-Cu 组与MH-Cu/Nb 组，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率均达到92%以上，效果显著，这可能与Cu 离子的释放相关。

综上所述，使用微弧氧化-微波水热两步法对纯钛表面改性，成功制备了含铜、铌、钙、磷等活性元素的粗糙多孔涂层，有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长。然而铜铌涂层的抗菌机制及对于其他优势菌属的抗菌性能还需进一步研究。

【Author contributions】Wang TQ performed the experiments and wrote the article. Du Q and Xie WL designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.