空气中颗粒物对耐药基因接合转移的影响

王丽芳， 孙红卫， 董辉伟， 陈郑珊， 谭 蓉， 程春燕， 杨 栋*， 李君文*

(滨州医学院公共卫生与管理学院， 山东烟台 264000)

颗粒物又称粉尘，是空气污染物的主要成分，颗粒物根据空气动力学直径分为粗颗粒物(空气动力学直径≤10 μm，PM10)，细颗粒物(空气动力学直径≤2.5 μm，PM2.5)和超细颗粒物(空气动力学直径≤0.1 μm，PM0.1)〔1-2〕。三者统称为可吸入颗粒物，根据空气动力学直径的大小决定其在呼吸系统沉积部位，PM10主要沉积在上呼吸道〔3〕，PM2.5和PM0.1可到达肺部,进而影响人体的健康。流行病学研究表明，颗粒物不仅影响呼吸系统和心血管系统、而且还可以通过影响体内的物质代谢进而影响肝脏、肾脏以及肠道菌群〔4〕。空气中颗粒物成分复杂多样，主要包括有机碳(OC)、碳单质(EC)、金属元素、水溶性无机离子、细菌、内毒素、抗生素耐药基因(ARGs)等〔5-9〕。而不同时间、不同区域颗粒物的成分也存在差异，而其成分影响其毒性结果〔10-11〕。 细菌主要通过自身基因突变和水平转移的方式获得耐药性，细菌自发突变率低，且不稳定，而后者是细菌获得耐药性的主要方式。细菌间发生基因水平转移主要有3种方式：接合、转化和转导。接合转移是环境中耐药基因水平转移最常见、最有效的方式，对细菌耐药性的获得具有重要作用〔12〕。土壤和水环境中已经发现多种耐药基因甚至多重耐药基因〔13-16〕，随着人们对颗粒物成分研究的不断加深，空气中耐药基因的扩散和传播引起人们的关注。本研究主要探讨空气中不同粒径颗粒物对耐药基因接合转移的影响。从而制定有效的环境保护措施，进而减少耐药基因的扩散和传播。

1 材料和方法

1.1 菌株和试剂

1.1.1菌种 供体菌为带有RP4质粒的大肠埃希菌E.coli MG1655，具有卡那霉素(Km)、氨苄青霉素(Amp)以及四环素(Tc)三重抗性。受体菌为具有美罗培南(Mem)抗性的肺炎克雷伯菌。菌株为本实验室保存。

1.1.2抗生素 Tc溶液(购置上海生工生物工程有限公司)，浓度50 mg/mL，用0.22 μm滤膜过滤后，-20 ℃保存 ，备用。Mem购置北京索莱宝科技有限公司，用灭菌水配置成浓度为5 mg/mL溶液，用0.22 μm滤膜过滤后，-20 ℃保存 ，备用。

1.1.3颗粒物 PM0.1用纳米二氧化硅替代，购置Sigma公司。PM2.5、PM10购置美国Protein Technologies Inc(PTI)。SRM 1648a Urban Particulate Matter(1648a)：美国城市颗粒物标准品，购置东莞市景源实验科技有限公司。

1.1.4培养基 LB液体培养基：称取10 gNaCL、10 g胰蛋白胨和5 g酵母粉(购置美国BD公司)，溶于1 L蒸馏水中，充分摇晃，混合均匀后，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后保存于4 ℃冰箱待用。LB琼脂培养基：主要成分与LB液体培养基成分相同，在LB液体培养基溶解后再加入15 g琼脂粉(购置上海生工生物工程有限公司)，121 ℃，20 min高压灭菌后冷却备用。使用前加热煮沸，待冷却至50 ℃左右加入抗生素摇匀使用。

1.1.5试剂和仪器 0.9%的生理盐水：称取氯化钠9 g(购置天津市汇杭化工科技有限公司)溶于1 L蒸馏水中，121 ℃，20 min高压灭菌后冷却备用。活性氧(ROS)测定试剂盒购置南京建成生物工程研究所。

1.2 接合实验将大肠埃希菌(RP4)接种于含有40 μg/mL Tc的LB培养基中，肺炎克雷伯接种于含有2 μg/mL Mem的LB培养基，在37 ℃，150 rpm，摇床过夜培养16小时后，6000 rpm/5 min离心。用生理盐水清洗重悬2次，测OD600值，调整菌液浓度。取等量的供体菌和受体菌，各4.75 mL,进行后续实验。

1.2.1不同浓度颗粒物对耐药基因接合转移的影响 (1)不同浓度的PM0.1对耐药基因接合转移的影响。取9.5 mL初始浓度为108 CFU/mL供体菌和受体菌混合液5份，向其中4份分别加入0.5 mL浓度分别为1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL的PM0.1(纳米二氧化硅)储备液，使其终浓度分别达到62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，向剩余的1份中加入0.5 mL生理盐水作为空白对照。将所有的接合菌液混匀后，迅速置于37 ℃恒温培养箱中进行接合，每2个小时混匀1次，接合8 h后取出进行接合子筛选。(2)不同浓度的PM2.5、PM10和1648a对耐药基因接合转移的影响。PM2.5、PM10和1648a实验条件和PM0.1保持一致。

1.3 接合子的筛选和鉴定把接合体系稀释到一定浓度，用含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB固体培养基倾注平板筛选接合子。用6 μg/mL的Mem LB固体培养基倾注平板筛选受体菌。平板至于37 ℃培养箱36小时。计算接合子和受体菌的数量。为检验选择平板筛选的耐药细菌均为接合子，排除E.coli MG1655(RP4)或肺炎克雷伯菌自发突变子的干扰，本实验在设立上述组别的同时还分别设立E.coli MG1655(RP4)对照组和肺炎克雷伯菌对照组，各对照组分别加入上述浓度的颗粒物处理,筛选方法与实验组相同。在双抗筛选出的平板上，随意挑单克隆在含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB进行培养，观察细菌的生长情况。

1.4 接合频率的计算接合转移率计算公式如下：F=No.t/No.m；F.接合转移频率，No. t.接合子数量(cfu/mL)，No.m.受体菌数量(cfu/mL)。

1.5 颗粒物对细胞内ROS水平的影响使用DCFH-DA探针，按照制造商说明书测定细胞内ROS水平。使用酶标仪检测激发波长500，发射波长525处的ROS水平。并通过实验组和对照组的荧光强度比值进行评价。

2 结果

2.1PM0.1、PM2.5、PM10对耐药基因接合转移的影响对照组接合转移率为2.48×10-5，随着PM0.1、PM2.5、PM10、1648a浓度的增加，耐药基因的接合转移率先增加后下降。浓度为62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL时，PM0.1、PM2.5、PM10、1648a对耐药基因接合转移表现出促进作用，其中PM0.1组接合转移率2.85×10-5～1.94×10-4;2.38×10-5～1×10-4;1.43×10-5～4.64×10-4。PM2.5组接合转移率2.03×10-5～2.04×10-4;2.37×10-5～2.59×10-4;1.34×10-5～2.34×10-4。PM10组接合转移率3.19×10-5～3.07×10-4;3.59×10-5～2.77×10-4;4.4×10-5～3.12×10-4。1648a组接合转移率2.14×10-5～3×10-4;5.8×10-5～4.9×10-4;6.7×10-5～4.85×10-4。当浓度为500 μg/mL，四者对耐药基因的接合转移都表现出抑制作用，但都无统计学差异。这一结果表明颗粒物对耐药基因接合转移的作用与颗粒物浓度和空气动力学直径有关。见图1。

图1 不同浓度不同颗粒物对耐药基因接合转移的影响(*P<0.05)

2.2 活性氧含量颗粒物干预后，供体菌细胞内ROS明显升高，且与对照组存在统计学差异(P<0.05)。受体菌细胞内ROS变化不明显，有时甚至下降。除了PM10,125 μg/mL，其他组都与对照组存在差异(P<0.05)。见图2-5。

图2 PM2.5对细胞内ROS的影响(*P<0.05)

图3 PM10对细胞内ROS的影响(*P<0.05)

图4 1648a对细胞内ROS的影响(*P<0.05)

图5 纳米二氧化硅对细胞内ROS的影响(*P<0.05)

3 讨论

ARGs被认为是存在于水、土壤和空气环境中新型持续性污染物〔13-16〕。2020年CHINET中国细菌耐药监测临床分离菌种排名前五位分离株分别是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金葡菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，呼吸道标本中前5位占据其中4个，据报道，颗粒物可以载带细菌或ARGs〔17, 18〕,而且颗粒物主要通过呼吸进入体内，进而影响人体健康，可见颗粒物对耐药基因转移和扩散研究具有重要意义。在我国，生活在监测空气污染的城市地区的80%以上的人所接触的空气质量水平超过了世界卫生组织(WHO)的限值，而且颗粒物的长期暴露可使全球的预期期望寿命减少3年〔19〕。土壤和水中耐药基因的扩散传播研究已相当成熟，但大气中不同粒径颗粒物对耐药基因传播的影响还不太明确。故需要建立模型验证不同粒径颗粒物对耐药基因水平转移的影响。

在本研究中随着颗粒物浓度的增加，颗粒物对耐药基因接合转移的促进作用先增强后减弱。PM0.1的最佳促进浓度为62.5 μg/mL，约为空白对照组的4.1倍。PM2.5和PM10、1468a最佳促进浓度均为125 μg/mL，PM2.5约为空白对照组的3.9倍，PM10约为空白对照组的4.7倍。1648a约为空白对照组的8.5倍。可见颗粒物的空气动力学直径不同，对耐药基因接合转移的影响效果不尽相同。而颗粒物的作用效果随浓度的增加，有峰值的出现，可能原因是颗粒物在促进耐药基因接合转移的过程中，能够使细胞产生严重的氧化应激反应，产生ROS和SOS。有研究表明SOS和中等浓度的ROS可以增加细胞膜的通透性，削弱细胞膜屏障，增加遗传物质的转移，进而促进耐药基因的接合转移〔8〕。而颗粒物的浓度为500 μg/mL对耐药基因的接合转移表现出抑制作用，可能是高剂量的颗粒物对细菌有杀伤作用，导致细菌死亡〔20〕。有文献报道，随着初始菌量的减少，耐药菌之间的接合转移率呈现下降趋势〔21〕。而且大量颗粒物存在时，会粘附在细菌表面，减少细菌之间物理接触机会，从而减少耐药基因的接合转移。颗粒物还可以促进接合转移相关基因trbBp和trfAp的表达，从而增强耐药基因的接合转移〔8〕。

总的来说，空气污染已经成为全球性的公共卫生问题，特别是在中国的很多城市，冬季空气质量状况严重超过WHO空气质量限值，空气中颗粒物有可能促进空气中耐药基因的水平转移，引起耐药菌的增加和远程扩散，加重抗生素的负担。所以，控制环境中颗粒物浓度至关重要。本研究结果可以对将来修订空气中颗粒物限值提供参考依据,而且对控制空气中耐药基因的传播具有指导意义。